Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Toxoplasma gondii is 'n intrasellulêre protosoë parasiet wat die mikro-omgewing van die besmette gasheer moduleer en dit is bekend dat dit geassosieer word met die voorkoms van breingewasgroei.In hierdie studie veronderstel ons dat eksosomale miRNA-21 van Toxoplasma-infeksie breingewasgroei bevorder.Eksosome van Toxoplasma-geïnfekteerde BV2 mikroglia is gekarakteriseer en internalisering van U87 glioomselle is bevestig.Eksosomale mikroRNA uitdrukkingsprofiele is ontleed deur gebruik te maak van skikkings van mikroRNA en mikroRNA-21A-5p wat met Toxoplasma gondii en tumorsortering geassosieer word.Ons het ook die mRNA-vlakke van tumor-geassosieerde gene in U87-glioomselle ondersoek deur miR-21-vlakke in eksosome en die effek van eksosome op menslike U87-glioomselproliferasie te verander.In eksosome van U87-glioomselle wat met Toxoplasma gondii besmet is, word die uitdrukking van mikroRNA-21 verhoog en die aktiwiteit van antitumorgene (FoxO1, PTEN en PDCD4) word verminder.BV2-afgeleide eksosome wat met Toxoplasma besmet is, veroorsaak proliferasie van U87 glioomselle.Eksosome veroorsaak groei van U87-selle in 'n muisgewasmodel.Ons stel voor dat verhoogde eksosomale miR-21 in Toxoplasma-geïnfekteerde BV2-mikroglia 'n belangrike rol kan speel as 'n selgroeibevorderaar in U87-glioomselle deur antitumor-gene af te reguleer.
Daar word beraam dat meer as 18,1 miljoen gevalle van gevorderde kanker wêreldwyd in 2018 gediagnoseer is, met ongeveer 297 000 gewasse in die sentrale senuweestelsel wat elke jaar gediagnoseer is (1,6% van alle gewasse)1.Vorige navorsing het getoon dat risikofaktore vir die ontwikkeling van menslike breingewasse verskeie chemiese produkte, familiegeskiedenis en ioniserende bestraling van kopterapeutiese en diagnostiese toerusting insluit.Die presiese oorsaak van hierdie maligniteite is egter onbekend.Ongeveer 20% van alle kankers wêreldwyd word veroorsaak deur aansteeklike middels, insluitend virusse, bakterieë en parasiete3,4.Aansteeklike patogene ontwrig die gasheersel se genetiese meganismes, soos DNA-herstel en die selsiklus, en kan lei tot chroniese inflammasie en skade aan die immuunstelsel5.
Aansteeklike middels wat met menslike kanker geassosieer word, is die mees algemene virale patogene, insluitend menslike papillomavirusse en hepatitis B- en C-virusse.Parasiete kan ook 'n potensiële rol speel in die ontwikkeling van menslike kanker.Verskeie parasietspesies, naamlik Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis en Hymenolepis nana, is by verskeie tipes menslike kanker 6,7,8 betrokke.
Toxoplasma gondii is 'n intrasellulêre protosoë wat die mikro-omgewing van besmette gasheerselle reguleer.Hierdie parasiet besmet na raming ongeveer 30% van die wêreld se bevolking, wat die hele bevolking in gevaar stel9,10.Toxoplasma gondii kan lewensbelangrike organe, insluitend die sentrale senuweestelsel (SNS), besmet en ernstige siektes soos dodelike meningitis en enkefalitis veroorsaak, veral by pasiënte met immuunonderdrukking9.Toxoplasma gondii kan egter ook die omgewing van die besmette gasheer verander deur selgroei en immuunresponse in immunokompetente individue te moduleer, wat lei tot die instandhouding van 'n asimptomatiese chroniese infeksie9,11.Interessant genoeg, gegewe die korrelasie tussen T. gondii-voorkoms en breingewasvoorkoms, dui sommige verslae daarop dat in vivo gasheer omgewingsveranderinge as gevolg van chroniese T. gondii-infeksie soos die tumormikro-omgewing lyk.
Eksosome staan ​​bekend as intersellulêre kommunikeerders wat biologiese inhoud, insluitend proteïene en nukleïensure, vanaf naburige selle lewer16,17.Eksosome kan tumorverwante biologiese prosesse soos anti-apoptose, angiogenese en metastase in die tumormikro-omgewing beïnvloed.Veral miRNA's (miRNA's), klein nie-koderende RNA's van ongeveer 22 nukleotiede lank, is belangrike post-transkripsionele geenreguleerders wat meer as 30% van menslike mRNA beheer deur die miRNA-geïnduseerde stilmaakkompleks (miRISC).Toxoplasma gondii kan biologiese prosesse ontwrig deur miRNA-uitdrukking in besmette gashere te beheer.Gasheer miRNAs bevat belangrike seine vir die regulering van gasheer biologiese prosesse om die parasiet se oorlewingstrategie te bereik.Dus, die bestudering van veranderinge in die gasheer miRNA profiel by infeksie met T. gondii kan ons help om die interaksie tussen die gasheer en T. gondii duideliker te verstaan.Inderdaad, Thirugnanam et al.15 het voorgestel dat T. gondii breinkarsinogenese bevorder deur die uitdrukking daarvan op spesifieke gasheer miRNA's wat met tumorgroei geassosieer word te verander en gevind dat T. gondii gliome in proefdiere kan veroorsaak.
Hierdie studie fokus op die verandering van eksosomale miR-21 in gasheer mikroglia geïnfekteer met Toxoplasma BV2.Ons het 'n moontlike rol van veranderde eksosomale miR-21 in die groei van U87-glioomselle waargeneem as gevolg van die retensie in die kern van FoxO1/p27, wat die teiken is van ooruitgedrukte miR-21.
Eksosome afkomstig van BV2 is verkry met behulp van differensiële sentrifugering en bekragtig deur verskeie metodes om kontaminasie met sellulêre komponente of ander vesikels te voorkom.SDS-poliakrielamied-gelelektroforese (SDS-PAGE) het duidelike patrone getoon tussen proteïene wat uit BV2-selle en eksosome onttrek is (Figuur 1A), en monsters is geassesseer vir die teenwoordigheid van Alix, wat geanaliseer is deur Western klad van eksosomale proteïenmerkers in.Alix-etikettering is gevind in eksosoomproteïene, maar nie in BV2-sellisaatproteïene nie (Fig. 1B).Daarbenewens is gesuiwerde RNA van eksosome afkomstig van BV2 ontleed met behulp van 'n bio-ontleder.18S en 28S ribosomale subeenhede is selde waargeneem in die eksosomale RNA-migrasiepatroon, wat betroubare suiwerheid aandui (Figuur 1C).Laastens het transmissie-elektronmikroskopie getoon dat die waargenome eksosome ongeveer 60-150 nm groot was en 'n koppieagtige struktuur gehad het wat tipies is van eksosoommorfologie (Fig. 1D).
Karakterisering van eksosome afkomstig van BV2-selle.(A) Veiligheidsdatabladbladsy.Proteïene is geïsoleer uit BV2-selle of eksosome afkomstig van BV2.Proteïenpatrone verskil tussen selle en eksosome.(B) Western klad-analise van 'n eksosomale merker (Alix).(C) Evaluering van gesuiwerde RNA van BV2-selle en BV2-afgeleide eksosome met behulp van 'n bio-ontleder.Dus is 18S en 28S ribosomale subeenhede in BV2 selle selde in eksosomale RNA gevind.(D) Transmissie-elektronmikroskopie het getoon dat eksosome wat uit BV2-selle geïsoleer is, negatief gekleur is met 2% uranielasetaat.Eksosome is ongeveer 60-150 nm groot en koppievormig (Song en Jung, ongepubliseerde data).
Sellulêre internalisering van BV2-afgeleide eksosome in U87 menslike glioomselle is waargeneem met behulp van konfokale mikroskopie.PKH26-gemerkte eksosome is in die sitoplasma van U87-selle gelokaliseer.Kerne is gekleur met DAPI (Fig. 2A), wat aandui dat BV2-afgeleide eksosome deur gasheerselle geïnternaliseer kan word en die omgewing van ontvangerselle beïnvloed.
Internalisering van BV2-afgeleide eksosome in U87-glioomselle en BV2-afgeleide eksosome wat met Toxoplasma RH besmet is, het proliferasie van U87-glioomselle geïnduseer.(A) Eksosome verswelg deur U87-selle gemeet deur konfokale mikroskopie.U87 glioom selle is geïnkubeer met eksosome gemerk met PKH26 (rooi) of sonder kontrole vir 24 uur.Die kerne is met DAPI (blou) gekleur en dan onder 'n konfokale mikroskoop (skaalbalk: 10 μm, x 3000) waargeneem.(B) U87 glioom sel proliferasie is bepaal deur sel proliferasie toets.U87 glioomselle is vir die aangeduide tyd met eksosome behandel. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 volgens Student se t-toets. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 verkry deur Student se t-toets.
Nadat ons die internalisering van BV2-afgeleide eksosome in U87-glioomselle bevestig het, het ons selproliferasietoetse uitgevoer om die rol van BV2-afgeleide Toxoplasma-afgeleide eksosome in die ontwikkeling van menslike glioomselle te ondersoek.Behandeling van U87-selle met eksosome van T. gondii-geïnfekteerde BV2-selle het getoon dat T. gondii-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome aansienlik hoër proliferasie van U87-selle veroorsaak het in vergelyking met kontrole (Fig. 2B).
Boonop het groei van U118-selle dieselfde resultate as U87 gehad, aangesien Toxoplasma-gestimuleerde eksosome die hoogste vlakke van proliferasie veroorsaak het (data nie getoon nie).Gebaseer op hierdie data, kan ons aandui dat BV2-afgeleide Toxoplasma-geïnfekteerde eksosome 'n belangrike rol speel in glioomselproliferasie.
Om die effek van Toxoplasma-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome op tumorontwikkeling te ondersoek, het ons U87-glioomselle in naakte muise ingespuit vir 'n xenotransplantaatmodel en BV2-afgeleide eksosome of RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome ingespuit.Nadat gewasse na 1 week sigbaar geword het, is elke eksperimentele groep van 5 muise volgens gewasgrootte verdeel om dieselfde beginpunt te bepaal, en gewasgrootte is vir 22 dae gemeet.
In muise met die U87 xenograft model, is aansienlik groter tumor grootte en gewig waargeneem in die BV2-afgeleide RH-geïnfekteerde eksosoom groep op dag 22 (Fig. 3A, B).Aan die ander kant was daar geen betekenisvolle verskil in tumorgrootte tussen die BV2-afgeleide eksosoomgroep en die kontrolegroep na eksosoombehandeling nie.Daarbenewens het muise wat met glioomselle en eksosome ingespuit is, visueel die grootste tumorvolume vertoon in die groep RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome (Fig. 3C).Hierdie resultate toon dat BV2-afgeleide Toxoplasma-geïnfekteerde eksosome glioomgroei in 'n muisgewasmodel induseer.
Onkogenese (AC) van BV2-afgeleide eksosome in 'n U87 xenograft muismodel.Tumorgrootte (A) en gewig (B) is aansienlik verhoog in BALB/c naakmuise wat behandel is met RH-geïnfekteerde eksosome afkomstig van BV2.BALB/c naakmuise (C) is onderhuids ingespuit met 1 x 107 U87-selle wat in Matrigel-mengsel gesuspendeer is.Ses dae na inspuiting is 100 μg van BV2-afgeleide eksosome in muise behandel.Tumorgrootte en gewig is onderskeidelik op die aangeduide dae en na opoffering gemeet. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Die data het getoon dat 37 miRNA's (16 ooruitgedruk en 21 afwaarts uitgedruk) wat verband hou met immuniteit of tumorontwikkeling aansienlik verander is in mikroglia na infeksie met die Toxoplasma RH-stam (Fig. 4A).Relatiewe uitdrukkingsvlakke van miR-21 onder veranderde miRNAs is bevestig deur intydse RT-PCR in eksosome afgelei van BV2, eksosome behandel met BV2 en U87 selle.Uitdrukking van miR-21 het 'n beduidende toename in eksosome van BV2-selle wat met Toxoplasma gondii (RH-stam) besmet is, getoon (Fig. 4B).Relatiewe uitdrukkingsvlakke van miR-21 in BV2- en U87-selle het toegeneem na opname van veranderde eksosome (Fig. 4B).Die relatiewe vlakke van miR-21-uitdrukking in die breinweefsel van tumorpasiënte en muise wat met Toxoplasma gondii (ME49-stam) besmet is, was onderskeidelik hoër as in kontroles (Fig. 4C).Hierdie resultate korreleer met verskille tussen die uitdrukkingsvlakke van voorspelde en bevestigde mikroRNA's in vitro en in vivo.
Veranderinge in die uitdrukking van eksosomale miP-21a-5p in mikroglia wat met Toxoplasma gondii (RH) besmet is.(A) Demonstreer beduidende veranderinge in siRNA wat verband hou met immuniteit of tumorontwikkeling na T. gondii RH-infeksie.(B) Relatiewe miR-21 uitdrukkingsvlakke is opgespoor deur intydse RT-PCR in BV2-afgeleide eksosome, BV2-behandelde eksosome en U87-selle.(C) Relatiewe miR-21 uitdrukkingsvlakke is gevind in die breinweefsels van tumorpasiënte (N=3) en muise wat met Toxoplasma gondii (ME49-stam) (N=3) besmet is. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0,05 vir 'n telling met 'n t-kredietwaarde. *P < 0.05 is verkry met behulp van Student se t-toets. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 verkry deur Student se t-toets.
Eksosome van RH-geïnfekteerde BV2-selle het gelei tot die groei van gliomas in vivo en in vitro (Fig. 2, 3).Om relevante mRNA's op te spoor, het ons mRNA-vlakke van antitumor-teikengene, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN en geprogrammeerde seldood 4 (PDCD4) in U87-selle wat met eksosome wat van BV2 of RH BV2 geïnfekteer is, ondersoek.Bioinformatika-analise het getoon dat verskeie tumor-geassosieerde gene, insluitend die FoxO1-, PTEN- en PDCD4-gene, miR-2121,22-bindingsplekke het.mRNA-vlakke van antitumor-teikengene is verminder in RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome in vergelyking met BV2-afgeleide eksosome (Fig. 5A).FoxO1 het verminderde proteïenvlakke in RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome getoon in vergelyking met BV2-afgeleide eksosome (Figuur 5B).Gebaseer op hierdie resultate, kon ons bevestig dat eksosome afgelei van RH-geïnfekteerde BV2 anti-onkogene gene afreguleer, wat hul rol in tumorgroei handhaaf.
Toxoplasma RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome veroorsaak onderdrukking van antitumor-gene in U87-glioomselle deur Toxoplasma RH-geïnfekteerde BV2-afgeleide eksosome.(A) Real-time PCR van FoxO1, PTEN en PDCD4 uitdrukking in eksosome afgelei van T. gondii RH-geïnfekteerde BV2 in vergelyking met PBS eksosome.β-aktien mRNA is as kontrole gebruik.(B) FoxO1 uitdrukking is bepaal deur Western blotting en densitometrie data is statisties geëvalueer met behulp van die ImageJ program. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0.05 is deur Student se t-toets behaal. *P < 0,05 vir 'n telling met 'n t-kredietwaarde. *P < 0.05 is verkry met behulp van Student se t-toets. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 verkry deur Student se t-toets.
Om die effek van miP-21 in eksosome op tumor-geassosieerde geenregulering te verstaan, is U87-selle getransfekteer met 'n inhibeerder van miP-21 met behulp van Lipofectamine 2000 en die selle is 24 uur na transfektasie geoes.FoxO1 en p27 uitdrukking vlakke in selle getransfekteer met miR-21 inhibeerders is vergelyk met selle behandel met BV2-afgeleide eksosome met behulp van qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfeksie van die miR-21-inhibeerder in U87-selle het FoxO1- en p27-uitdrukking aansienlik verlaag (FIG. 6).
RH-geïnfekteerde eksosomale BV2-afgeleide miP-21 het FoxO1/p27-uitdrukking in U87-glioomselle verander.U87 selle is getransfekteer met miP-21 inhibeerder met behulp van Lipofectamine 2000 en selle is 24 uur na transfeksie geoes.FoxO1 en p27 uitdrukkingsvlakke in selle wat met miR-21 inhibeerders getransfekteer is, is vergelyk met vlakke in selle wat met BV2-afgeleide eksosome behandel is deur gebruik te maak van qRT-PCR (A, B).
Om die gasheer se immuunrespons te ontsnap, verander die Toxoplasma-parasiet in 'n weefselsist.Hulle parasiteer verskeie weefsels, insluitend die brein, hart en skeletspier, dwarsdeur die leeftyd van die gasheer en moduleer die gasheer se immuunrespons.Daarbenewens kan hulle die selsiklus en apoptose van gasheerselle reguleer, wat hul proliferasie bevorder14,24.Toxoplasma gondii infekteer hoofsaaklik gasheer dendritiese selle, neutrofiele en monosiet-/makrofage-lyn, insluitend breinmikroglia.Toxoplasma gondii veroorsaak die differensiasie van makrofage van die M2-fenotipe, beïnvloed wondgenesing na patogeeninfeksie, en word ook geassosieer met hipervaskularisasie en granulomatiese fibrose.Hierdie gedragspatogenese van Toxoplasma-infeksie kan verband hou met merkers wat verband hou met tumorontwikkeling.Die vyandige omgewing wat deur Toxoplasma gereguleer word, kan soos die ooreenstemmende voorkanker lyk.Daarom kan aanvaar word dat Toxoplasma-infeksie moet bydra tot die ontwikkeling van breingewasse.Trouens, hoë koerse van Toxoplasma-infeksie is aangemeld in die serum van pasiënte met verskeie breingewasse.Daarbenewens kan Toxoplasma gondii nog 'n karsinogene effektor wees en sinergisties optree om ander aansteeklike karsinogene te help om breingewasse te ontwikkel.In hierdie verband is dit opmerklik dat P. falciparum en Epstein-Barr-virus sinergisties bydra tot die vorming van Burkitt se limfoom.
Die rol van eksosome as reguleerders in die veld van kankernavorsing is omvattend ondersoek.Die rol van eksosome tussen parasiete en besmette gashere bly egter swak verstaan.Tot dusver het verskeie reguleerders, insluitend afgeskeide proteïene, die biologiese prosesse verduidelik waardeur protosoë parasiete gasheeraanval weerstaan ​​en infeksie voortduur.Onlangs was daar 'n groeiende konsep dat protosoë-geassosieerde mikrovesikels en hul mikro-RNA's met gasheerselle in wisselwerking tree om 'n gunstige omgewing vir hul oorlewing te skep.Daarom is verdere studies nodig om die verband tussen veranderde eksosomale miRNA's en glioomselproliferasie te ontdek.MikroRNA-verandering (clustergene miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 en miR-17-92) bind aan die STAT3-promotor in toksoplasma-geïnfekteerde menslike makrofage, word gereguleer en induseer anti -apoptose in reaksie op Toxoplasma gondii infeksie 29 .Toxoplasma-infeksie verhoog die uitdrukking van miR-17-5p en miR-106b-5p, wat met verskeie hiperproliferatiewe siektes geassosieer word 30 .Hierdie data dui daarop dat gasheer miRNAs gereguleer deur Toxoplasma infeksie is belangrike molekules vir parasiet oorlewing en patogenese in gasheer biologiese gedrag.
Veranderde miRNAs kan verskeie tipes gedrag beïnvloed tydens die aanvang en progressie van kwaadaardige selle, insluitend gliomas: selfgenoegsaamheid van groeiseine, onsensitiwiteit vir groei-inhiberende seine, apoptose-ontduiking, onbeperkte replikatiewe potensiaal, angiogenese, indringing en metastase, en inflammasie.In glioom is veranderde miRNA's in verskeie uitdrukkingsprofielstudies geïdentifiseer.
In die huidige studie het ons hoë vlakke van miRNA-21 uitdrukking in toksoplasma-geïnfekteerde gasheerselle bevestig.miR-21 is geïdentifiseer as een van die mees gereelde ooruitgedrukte mikroRNA's in soliede gewasse, insluitend gliomas, 33 en die uitdrukking daarvan korreleer met die graad van glioom.Opeenhopende bewyse dui daarop dat miR-21 'n nuwe onkogeen is wat as 'n anti-apoptotiese faktor in glioomgroei optree en hoogs ooruitgedruk word in weefsels en plasma van menslike breinmaligniteite.Interessant genoeg veroorsaak miR-21-inaktivering in glioomselle en -weefsels die inhibisie van selproliferasie as gevolg van kaspase-afhanklike apoptose.Bio-informatiese analise van miR-21 voorspelde teikens het veelvuldige tumoronderdrukkergene geassosieer met apoptose-bane geopenbaar, insluitend geprogrammeerde seldood 4 (PDCD4), tropomiosien (TPM1), PTEN, en forkhead box O1 (FoxO1), met die miR-2121-bindingsplek..22.38.
FoxO1, as een van die transkripsiefaktore (FoxO), is betrokke by die ontwikkeling van verskeie tipes menslike kanker en kan die uitdrukking van tumoronderdrukkergene soos p21, p27, Bim en FasL40 reguleer.FoxO1 kan selliklus-inhibeerders soos p27 bind en aktiveer om selgroei te onderdruk.Boonop is FoxO1 'n sleuteleffektor van PI3K/Akt-sein en reguleer baie biologiese prosesse soos selsiklusprogressie en seldifferensiasie deur aktivering van p2742-transkripsie.
Ten slotte glo ons dat eksosomale miR-21 afkomstig van Toxoplasma-geïnfekteerde mikroglia 'n belangrike rol kan speel as 'n groeireguleerder van glioomselle (Fig. 7).Verdere studies is egter nodig om 'n direkte verband tussen eksosomale miR-21, veranderde Toxoplasma-infeksie en glioomgroei te vind.Hierdie resultate sal na verwagting 'n beginpunt bied vir die bestudering van die verband tussen Toxoplasma-infeksie en die voorkoms van glioom.
'n Skematiese diagram van die meganisme van glioom (brein) karsinogenese word in hierdie studie voorgestel.Die skrywer teken in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle eksperimentele protokolle in hierdie studie, insluitend die gebruik van diere, was in ooreenstemming met die Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines en is goedgekeur deur die Institusionele Hersieningsraad van die Seoul National University School of Medicine (IRB-nommer SNU- 150715).-2).Alle eksperimentele prosedures is uitgevoer in ooreenstemming met ARRIVE-aanbevelings.
BV2 muis mikroglia en U87 menslike glioom selle is onderskeidelik gekweek in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) en Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), wat elk 10% fetale bees serum bevat, 4 mM l- glutamien, 0,2 mM penisillien en 0,05 mM streptomisien.Selle is gekweek in 'n broeikas met 5% CO2 by 37°C.Nog 'n glioomsellyn, U118, is gebruik vir vergelyking met U87-selle.
Om eksosome van T. gondii-geïnfekteerde RH- en ME49-stamme te isoleer, is T. gondii-tachyzoites (RH-stam) geoes vanaf die buikholte van 6-week-oue BALB/c-muise wat 3-4 dae tevore ingespuit is.Tachyzoites is drie keer met PBS gewas en gesuiwer deur sentrifugering in 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA)43.Om tagisoïete van stam ME49 te verkry, is BALB/c muise intraperitoneaal met 20 weefselsiste ingespuit en tagisoïettransformasie in siste is versamel deur die buikholte op die 6-8ste dag na infeksie (PI) te was.Muise wat met PBS besmet is.ME49-tagysoïete is gekweek in selle aangevul met 100 μg/ml penisillien (Gibco/BRL, Grand Island, NY, VSA), 100 μg/ml streptomisien (Gibco/BRL) en 5% fetale beeserum (Lonza, Walkersville, MD) .., VSA) by 37 °C en 5% koolstofdioksied.Na verbouing in Vero-selle is ME49-tagysoïete twee keer deur 'n 25 gauge naald en dan deur 'n 5 µm filter gevoer om puin en selle te verwyder.Na was, is die tagyzoiete in PBS44 hersuspendeer.Weefsel siste van Toxoplasma gondii stam ME49 is onderhou deur intraperitoneale inspuiting van siste geïsoleer uit die brein van geïnfekteerde C57BL/6 muise (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Die brein van ME49-geïnfekteerde muise is na 3 maande van PI geoes en onder 'n mikroskoop fyngemaak om siste te isoleer.Die besmette muise is onder spesiale patogeenvrye toestande (SPF) by die Seoul National University School of Medicine gehou.
Totale RNA is onttrek uit BV2-afgeleide eksosome, BV2-selle en weefsels met behulp van die miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens die vervaardiger se instruksies, insluitend die inkubasietyd vir die elutiestap.Die RNA-konsentrasie is op 'n NanoDrop 2000 spektrofotometer bepaal.Die kwaliteit van RNA-mikroskikkings is geassesseer met behulp van 'n Agilent 2100 bio-ontleder (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederland).
DMEM met 10% eksosoom-arm FBS is voorberei deur ultrasentrifugering by 100,000g vir 16 uur by 4°C en gefiltreer deur 'n 0.22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, VSA).BV2-selle, 5 × 105, is gekweek in DMEM wat 10% eksosoom-uitgeput FBS en 1% antibiotika by 37°C en 5% CO2 bevat.Na 24 uur se inkubasie is tagisoïete van stam RH of ME49 (MOI = 10) by die selle gevoeg en nie-indringer parasiete is binne 'n uur verwyder en hervul met DMEM.Eksosome van BV2-selle is geïsoleer deur gemodifiseerde differensiële sentrifugering, die mees gebruikte metode.Hersuspendeer die eksosoomkorrel in 300 µl PBS vir RNA- of proteïenanalise.Die konsentrasie van geïsoleerde eksosome is bepaal met behulp van 'n BCA-proteïentoetsstel (Pierce, Rockford, IL, VSA) en 'n NanoDrop 2000 spektrofotometer.
Presipitate van BV2-selle of eksosome afkomstig van BV2 is in PRO-PREP™-proteïenekstraksie-oplossing (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) gelys en proteïene is op Coomassie briljantblou-gekleurde 10% SDS-poliakrielamiedgels gelaai.Daarbenewens is proteïene vir 2 uur na PVDF-membrane oorgedra.Western blots is bekragtig deur gebruik te maak van die Alix-teenliggaam (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VSA) as 'n eksosomale merker.HRP-gekonjugeerde bok anti-muis IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, VSA) en 'n LAS-1000 plus luminescerende beeldontleder (Fuji Photographic Film, Tokio, Japan) is as 'n sekondêre teenliggaam gebruik..Transmissie-elektronmikroskopie is uitgevoer om die grootte en morfologie van eksosome te bestudeer.Eksosome wat uit BV2-selle geïsoleer is (6.40 µg/µl) is op koolstofbedekte maas voorberei en negatief gekleur met 2% uranielasetaat vir 1 min.Die voorbereide monsters is waargeneem teen 'n versnellende spanning van 80 kV met behulp van 'n JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) toegerus met 'n ES1000W Erlangshen CCD-kamera (Gatan, Pleasanton, CA, VSA).
BV2-afgeleide eksosome is gekleur met die PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSA) vir 15 minute by kamertemperatuur.U87-selle, 2×105, met PKH26-gemerkte eksosome (rooi) of geen eksosome as 'n negatiewe kontrole, is by 37°C vir 24 uur in 'n 5% CO2 broeikas geïnkubeer.U87-selkerne is met DAPI (blou) gekleur, U87-selle is vir 15 min by 4°C in 4% paraformaldehied gefixeer en dan ontleed in 'n Leica TCS SP8 STED CW konfokale mikroskoopstelsel (Leica Microsystems, Mannheim, Duitsland).waarneembaar.
cDNA is gesintetiseer vanaf siRNA met behulp van Mir-X siRNA eerste string sintese en SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Intydse kwantitatiewe PCR is uitgevoer met behulp van die iQ5 intydse PCR-opsporingstelsel (Bio-Rad, Hercules, CA, VSA) deur gebruik te maak van primers en templates gemeng met SYBR Premix.DNA is geamplifiseer vir 40 siklusse van denaturasie by 95°C vir 15 s en uitgloeiing by 60°C vir 60 s.Die data van elke PCR-reaksie is ontleed met behulp van die data-ontledingsmodule van die iQ™5 optiese stelselsagteware (Bio-Rad).Relatiewe veranderinge in geenuitdrukking tussen geselekteerde teikengene en β-aktien/siRNA (en U6) is met behulp van die standaard kurwe metode bereken.Die primervolgordes wat gebruik word, word in Tabel 1 getoon.
3 x 104 U87 glioomselle is in 96-put plate gesaai en gemeng met Toxoplasma-geïnfekteerde eksosome afgelei van BV2 (50 μg/ml) of nie-puls eksosome afgelei van BV2 (50 μg/ml) as kontroles op 12, 18 en 36 uur .Die selproliferasietempo is bepaal met behulp van die Sel Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Aanvullende Figure S1-S3) 46 .
5-week-oue vroulike BALB/c naakmuise is by Orient Bio (Seongnam-si, Suid-Korea) gekoop en individueel in steriele hokke by kamertemperatuur (22±2°C) en humiditeit (45±15°C) gehou.%) by kamertemperatuur (22±2°C) en humiditeit (45±15%).'n 12-uur lig siklus en 'n 12-uur donker siklus is uitgevoer onder SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Centre).Muise is ewekansig in drie groepe van 5 muise elk verdeel en alle groepe is onderhuids ingespuit met 400 ml PBS wat 1 x 107 U87 glioomselle bevat en groeifaktor verlaagde BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, VSA).Ses dae na tumorinspuiting is 200 mg eksosome afkomstig van BV2-selle (met/sonder Toxoplasma-infeksie) in die tumorplek ingespuit.Twee-en-twintig dae na gewasinfeksie is die gewasgrootte van muise in elke groep drie keer per week met 'n pasmaat gemeet, en die gewasvolume is bereken deur die formule: 0.5×(breedte)×2×lengte.
MikroRNA-uitdrukkingsanalise met behulp van miRCURYTM LNA miRNA-skikking, 7de generasie het, mmu- en rno-skikkings (EXIQON, Vedbaek, Denemarke) wat 1119 goedgekarakteriseerde muise onder 3100 menslike, muis- en rot-miRNA-vangprobes dek.Tydens hierdie prosedure is 250 tot 1000 ng van totale RNA van die 5'-fosfaat verwyder deur behandeling met kalfderm alkaliese fosfatase gevolg deur etikettering met Hy3 groen fluoresserende kleurstof.Die gemerkte monsters is dan gehibridiseer deur mikroskikkingskyfies te laai deur gebruik te maak van 'n hibridisasiekamerstel (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VSA) en 'n hibridisasieskyfiestel (Agilent Technologies).Hibridisering is vir 16 uur by 56°C uitgevoer, daarna is die mikroskikkings gewas in ooreenstemming met die vervaardiger se aanbevelings.Die verwerkte mikroskikkingskyfies is dan geskandeer met behulp van 'n Agilent G2565CA mikroskikkingskandeerderstelsel (Agilent Technologies).Geskandeerde beelde is ingevoer met behulp van Agilent Feature Extraction sagteware weergawe 10.7.3.1 (Agilent Technologies) en die fluoressensie intensiteit van elke beeld is gekwantifiseer deur gebruik te maak van die ooreenstemmende GAL lêer van die gewysigde Exiqon protokol.Mikroskikkingsdata vir die huidige studie word in die GEO-databasis onder toegangsnommer GPL32397 gedeponeer.
Uitdrukkingsprofiele van volwasse eksosomale miRNA's in mikroglia van RH- of ME49-stamme wat met Toxoplasma besmet is, is met behulp van verskeie netwerkinstrumente ontleed.miRNAs wat met tumorontwikkeling geassosieer word, is met behulp van miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) geïdentifiseer en met genormaliseerde seinintensiteit (log2) groter as 8.0 uitgefiltreer.Onder miRNAs is gevind dat differensieel uitgedrukte miRNAs meer as 1.5-voudig verander word deur filteranalise van miRNAs verander deur RH of ME49-stamme wat met T. gondii besmet is.
Selle is gesaai in ses-put plate (3 x 105 selle/put) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, VSA) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VSA).Die getransfekteerde selle is vir 6 uur gekweek en dan is die medium na vars volledige medium verander.Selle is 24 uur na transfeksie geoes.
Statistiese analise is hoofsaaklik uitgevoer met behulp van Student se t-toets met Excel-sagteware (Microsoft, Washington, DC, VSA).Vir eksperimentele diereanalise is 'n tweerigting ANOVA uitgevoer met behulp van Prism 3.0 sagteware (GraphPad Software, La Jolla, CA, VSA). P-waardes < 0.05 is as statisties beduidend beskou. P-waardes < 0.05 is as statisties beduidend beskou. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-waardes <0.05 is as statisties beduidend beskou. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-waardes <0.05 is as statisties beduidend beskou.
Alle eksperimentele protokolle wat in hierdie studie gebruik is, is deur die Institusionele Hersieningsraad van die Seoul National University School of Medicine (IRB-nommer SNU-150715-2) goedgekeur.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Geskatte wêreldwye kankervoorkoms en -sterftes in 2018: GLOBOCAN-bronne en -metodes.Interpretasie.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 'n Insig in die risikofaktore van breingewasse en hul terapeutiese intervensies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 'n Insig in die risikofaktore van breingewasse en hul terapeutiese intervensies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS 'n Oorsig van risikofaktore vir breingewasse en groot terapeutiese intervensies. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Diep begrip van breingewas risikofaktore en terapeutiese intervensies.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS 'n Oorsig van risikofaktore vir breingewasse en groot terapeutiese intervensies.Biomediese wetenskap.Apteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteries-virale interaksies in menslike spysverteringskanaal en vroulike genitale kanaalkanker: 'n Opsomming van epidemiologiese en laboratoriumbewyse. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteries-virale interaksies in menslike spysverteringskanaal en vroulike genitale kanaalkanker: 'n Opsomming van epidemiologiese en laboratoriumbewyse.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bakteriële-virale interaksies in kanker van die menslike spysverteringskanaal en vroulike genitale kanaal: 'n opsomming van epidemiologiese en laboratoriumdata. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virale interaksie in menslike mondholte-vertering en vroulike voortplantingskanaal: opsomming van populêre siektewetenskap en laboratoriumbewyse.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bakteriële-virale interaksies in menslike gastroïntestinale kanker en vroulike geslagskanker: 'n opsomming van epidemiologiese en laboratoriumdata.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Van infeksie tot kanker: Hoe DNA-tumorvirusse gasheersel sentrale koolstof- en lipiedmetabolisme verander. Magon, KL & Parish, JL Van infeksie tot kanker: Hoe DNA-tumorvirusse gasheersel sentrale koolstof- en lipiedmetabolisme verander.Mahon, KL en Parish, JL Brandinfeksie vir kanker: hoe DNA-gebaseerde tumorvirusse gasheersel sentrale koolstof- en lipiedmetabolisme verander. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Van infeksie tot kanker: hoe DNA-tumorvirusse gasheersel sentrale koolstof- en lipiedmetabolisme verander.Mahon, KL en Parish, JL Brand infeksie teen kanker: hoe DNA-tumorvirusse sentrale koolstof- en lipiedmetabolisme in gasheerselle verander.Oop Biologie.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katekol-estrogeen van skistosome en lewerslak en helmint-geassosieerde kanker.voor.warm binne.5, 444 (2014).