Giardia duodenum is 'n parasitiese organisme wat giardiasis veroorsaak, 'n derminfeksie wat veral algemeen voorkom by jong kinders met kliniese tekens van diarree.Ons het voorheen gerapporteer dat ekstrasellulêre G. duodenalis die aktivering van intrasellulêre oligomerisering-agtige reseptor 3 (NLRP3) bindende nukleotiede veroorsaak en gasheer inflammatoriese response reguleer deur ekstrasellulêre vesikel (EV) afskeiding.Die presiese molekulêre patrone van die patogeen-geassosieerde duodenokokke EV (GEV) wat by hierdie proses betrokke is en die rol van die NLRP3-inflammasoom in giardiasis moet egter nog toegelig word.
Rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2 en alfa-7.3 giardiene in GEV is gekonstrueer, in muis primêre peritoneale makrofage getransfekteer en opgespoor deur die inflammasie teiken molekule caspase-1 te meet.Die p20 uitdrukkingsvlak is gekeur..G. duodenalis alfa-2 en alfa-7.3 giardines is oorspronklik geïdentifiseer deur NLRP3 inflammasoom (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 en caspase-1 p20), IL afskeiding te meet.1β-vlakke, apoptotiese gevlekte proteïen (ASC) oligomeriseringsvlakke, en immunofluorescerende lokalisering van NLRP3 en ASC.Die rol van die NLRP3-inflammasoom in die patogenisiteit van G. duodenalis is daarna geassesseer met behulp van muise waarin NLRP3-aktivering geblokkeer is (NLRP3-geblokkeerde muise) en patologiese veranderinge in liggaamsgewig, duodenale parasitiese lading en duodenale weefsel is gemonitor.Daarbenewens het ons ondersoek of hiardiene alfa-2 en alfa-7.3 IL-1β afskeiding in vivo via die NLRP3 inflammasoom induseer en die rol van hierdie molekules in die patogenisiteit van G. duodenalis in muise bepaal.
Alfa-2 en alfa-7.3 giardines veroorsaak die aktivering van die NLRP3 inflammasoom in vitro.Dit het gelei tot die aktivering van p20 kaspase-1, 'n toename in die uitdrukkingsvlakke van NLRP3, pro-IL-1β en pro-kaspase-1 proteïene, 'n beduidende toename in IL-1β afskeiding, die vorming van ASA kolle in die sitoplasma, en die induksie van ASA-oligomerisasie.NLRP3-ontsteking Penisverlies vererger die patogenisiteit van G. duodenalis by muise.Muise wat met siste behandel is deur sonde van NLRP3-geblokkeerde muise het 'n verhoogde aantal trofosoïete en ernstige skade aan die duodenale villi getoon, gekenmerk deur nekrotiese kripte met gekrimp en vertakking.In vivo eksperimente het getoon dat giardines alfa-2 en alfa-7.3 afskeiding van IL-1β via die NLRP3 inflammasoom kan induseer, en immunisering met giardines alfa-2 en alfa-7.3 het die patogenisiteit van G. duodenalis in muise verminder.
Saamgevat dui die resultate van hierdie studie daarop dat giardia alfa-2 en alfa-7.3 opregulering van gasheer NLRP3 inflammasie veroorsaak en die aansteeklikheid van G. duodenalis in muise verminder, wat belowende teikens is vir die voorkoming van giardiasis.
Giardia duodenum is 'n ekstrasellulêre protosoë parasiet wat in die dunderm woon en jaarliks ​​280 miljoen gevalle van giardiasis met diarree veroorsaak, veral onder jong kinders in ontwikkelende lande [1].Mense word besmet deur drinkwater of voedsel wat met M. duodenum-siste besmet is, wat dan die maag binnedring en in die maagsappe uitgeskei word.Giardia duodenum trophozoites heg aan die duodenale epiteel, wat naarheid, braking, diarree, abdominale pyn en gewigsverlies veroorsaak.Individue met immuniteitsgebrek en sistiese fibrose is vatbaar vir infeksie.Infeksie kan ook plaasvind deur orale en anale seks [2].Middels soos metronidasool, tinidasool en nitazoxanied is die voorkeurbehandelingsopsies vir duodenale infeksies [3].Hierdie chemoterapiemiddels veroorsaak egter nadelige newe-effekte soos naarheid, karsinogenese en genotoksisiteit [4].Daarom moet meer effektiewe strategieë ontwikkel word om G. duodenalis infeksie te voorkom.
Inflammasome is 'n klas sitosoliese proteïenkomplekse wat deel is van die aangebore immuunrespons, wat help om teen patogeen-indringing te verdedig en inflammatoriese reaksies te bemiddel [5].Onder hierdie inflammasome is nukleotied-bindende oligomerisasie (NOD) reseptor 3 (NLRP3) nukleotied-bindende oligomerisering (NLRP3) nukleotied-bindende-agtige inflammasoom omvattend bestudeer omdat dit opgespoor kan word deur verskeie patogeen/skade-geassosieerde molekulêre patrone (PAMP/ DAMP), herken, aktiveer die aangebore immuunstelsel.en reguleer intestinale homeostase in baie inflammatoriese siektes [6,7,8].Dit bestaan ​​uit die patroonherkenningsreseptor (PRR) NLRP3, 'n adaptor apoptotiese gevlekte proteïen (ASC), en 'n effektor procaspase-1 of procaspase-11.Die NLRP3-inflammasoom tree op as 'n gasheer teen patogeen-indringing, soos waargeneem in Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], en Leishmania studies.[11], maar dit is ook gerapporteer dat aktivering van die NLRP3-inflammasoom beskermende immuunresponse beperk en siektevordering vererger, byvoorbeeld in wurms [12].Gebaseer op ons vorige bevindinge, het ons gerapporteer dat ekstrasellulêre G. duodenalis intrasellulêre aktivering van NLRP3-inflammasie veroorsaak en gasheer inflammatoriese response moduleer deur ekstrasellulêre vesikels (EV's) af te skei [13].Die rol van die NLRP3 inflammasoom in G. duodenalis infeksie in vivo moet egter nog bepaal word.
Giardine is oorspronklik beskryf as strukturele komponente van die G. duodenalis sitoskelet en speel 'n belangrike rol in trofosoïet-motiliteit en epiteelselaanhegting in die dunderm.Om beter by die omgewing aan te pas en hul patogenisiteit te verhoog, het G. duodenalis trophozoites 'n unieke sitoskeletale struktuur ontwikkel wat bestaan ​​uit 8 flagella, 1 middelliggaam en 1 ventrale skyf [14].Die trofosoïete van Giardia duodenum gebruik hul sitoskelet om die boonste dunderm binne te dring, veral die duodenum, en heg aan enterosiete.Hulle migreer voortdurend en heg aan epiteelselle deur selmetabolisme te gebruik.Daarom is daar 'n noue verband tussen hul sitoskelet en virulensie.Giardines spesifiek vir Giardia duodenum is komponente van die sitoskeletstruktuur [15] en word in vier klasse verdeel: α-, β-, γ-, en δ-giardines.Daar is 21 lede van die α-giardin-familie, wat almal 'n kalsiumafhanklike vermoë het om fosfolipiede te bind [16].Hulle verbind ook die sitoskelet met die selmembraan.In individue met diarree wat deur G. duodenalis veroorsaak word, word α-giardiene hoogs uitgedruk en immunoreaktief tydens infeksie [17].Heteroloë entstowwe gebaseer op Giardia alfa-1 beskerm teen giardiasis in muise en is potensiële kandidaat-antigene vir entstofontwikkeling [18].Alfa-8 giardin, gelokaliseer in die plasmamembraan en flagella, maar nie in die ventrale skyf nie, verhoog die beweeglikheid en groeitempo van trofosoïete in G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin heg aan mikrotubuli strukture op flagella en beïnvloed die lewensvatbaarheid van G. duodenalis [20].Alfa-11-giardien is in oorvloed teenwoordig regdeur die lewensiklus, en ooruitdrukking van alfa-11-giardien beskadig G. duodenalis self [21].Dit is egter onduidelik of alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien beskermend is teen G. duodenalis-infeksie en hul onderliggende meganismes.
In hierdie studie is rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardien en pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardien in muis primêre peritoneale makrofage getransfekteer om gasheer NLRP3 te aktiveer.Inflammasome teikens is toe gekeur.Ons het ook die rol van die NLRP3-inflammasoom in die patogenisiteit van G. duodenalis geassesseer, ondersoek of alfa-2- en alfa-7,3-giardines aktivering van die NLRP3-inflammasoom in vivo induseer, en vasgestel dat hierdie twee rolle van giardines in die patogenisiteit van G. duodenalis.Ons gemeenskaplike doelwit was om belowende teikens vir die voorkoming van G. duodenalis-infeksie te ontwikkel.
Wildtipe (WT) C57BL/6 vroulike muise van 5-8 weke oud is by Liaoning Changsheng Eksperimentele Dieresentrum (Liaoning, China) gekoop.Muise het vrye toegang tot water gehad, het gesteriliseerde kos ontvang en is in 'n 12/12 uur lig/donker siklus gehou.Voor infeksie het muise antibiotika ad libitum ontvang in drinkwater aangevul met ampisillien (1 mg/ml), vankomisien (1 mg/ml) en neomisien (1,4 mg/ml) (almal gekoop van Sjanghai, China, kunsmatige organismes) [22 ].].Muise wat die vermoë om te eet en drink vir > 24 uur verloor en ≥ 20% liggaamsgewig verloor het, is menslik deur servikale ontwrigting gedood.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, VSA) is aangevul met 12,5% fetale beeserum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) en 0,1% beesgal (Sigma-Aldrich, St. Missouri, VSA) ).VSA) onder mikro-aërobiese toestande.Samevloeiende trofosoïete is op ys versamel en teen 'n verhouding van 1:4 deurgevoer vir verdere voortplanting.
Giardia duodenum siste is geïnduseer soos voorheen beskryf [23], trofosoïete is in logaritmiese fase geoes en dan verdun met inkapsulasie induserende medium, pH 7.1 (gemodifiseerde TYI-S-33) tot 'n finale konsentrasie van 1 × 106 trofosoïete/ml.galkonsentrasie 0,05% medium).Trophozoiete is onder anaërobiese toestande by 37°C gekweek tot die logaritmiese groeifase.Verander die medium na sist-induserende medium (pH 7.8; gemodifiseerde TYI-S-33-medium met 1% galkonsentrasie) en kweek G. duodenalis by 37°C vir 48–96 uur, waartydens die vormingsiste onder 'n mikroskoop waargeneem is.Nadat die meeste van die trofosoïete geïnduseer is om siste te vorm, is die kultuurmengsel geoes en in steriele gedeïoniseerde water gesuspendeer om die oorblywende trofosoïete te lyseer.Siste is getel en by 4°C gestoor vir daaropvolgende ontledings deur 'n maagbuis in muise.
Giardia ekstrasellulêre vesikels (GEVs) is verryk soos voorheen beskryf [13].Trofosoïete in logaritmiese groeifase is gehersuspendeer in gemodifiseerde TYI-S-33 medium voorberei met eksosoom-uitgeput FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) tot 'n finale konsentrasie van 1 × 106 parasiete/mL en vir 12 uur geïnkubeer.is uit die kultuursupernatant geïsoleer deur sentrifugering by 2000 g vir 10 min, 10 000 g vir 45 min en 100 000 g vir 60 min.Presipitate is in fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS) opgelos, gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n BCA proteïentoetsstel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA) en by -80°C gestoor of direk vir verdere ontledings gebruik.
Primêre muis peritoneale makrofage is voorberei soos voorheen beskryf [24].Kortliks, muise (ouderdom 6-8 weke) is (intraperitoneaal [ip]) ingespuit met 2.5 ml 2.98% Difco vloeibare tioglikol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, VSA) en 3-4 verhemelte gevoer.'n Suspensie van makrofage is versamel uit die buikholte van muise na genadedood en 3 keer gesentrifugeer by 1000 g vir 10 min.Geoesde selle is opgespoor deur vloeisitometrie deur die CD11b-merker te gebruik totdat selsuiwerheid >98% was, dan by 6-put selkultuurplate (4.5 x 106 selle/put) gevoeg en met 10% FBS (Bio-industrie) by 37°C geïnkubeer.en 5% CO2.
RNA is uit 1 × 107 trofozoiete in 1 ml TRIzol-reagens (Vazyme, Nanjing, China) onttrek, genomiese DNA is uit totale G. duodenalis RNA onttrek deur MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) en komplementêre DNA (cDNA) is gesintetiseer gebruik MonScript RTIIII Super Mix (Monad) volgens die vervaardiger se instruksies.
CDS volgorde inligting vir die teiken G. duodenalis geen is verkry vanaf die NCBI GenBank.Gebruik Primer 5.0 om spesifieke naatlose kloningsinleiders vir elke teikengeen te ontwerp.Die voorwaartse primer (5′-3′) bestaan ​​uit drie dele: 'n oorvleuelende volgorde met 'n gelineariseerde vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) en beginkodons ATG en GNN (indien die eerste basis nie G is nie).Dit word gedoen om die doeltreffendheid van die uitdrukking te verbeter.Daarbenewens, ten minste 16 bp gekombineerde basisse (GC-inhoud 40–60%/Tm ongeveer 55 °C).Die omgekeerde primer (5′-3′) bestaan ​​uit twee dele, 'n oorvleuelende volgorde met 'n EcoRV-gelineariseerde vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) en 'n gekombineerde basis van ten minste 16 bp.(uitgesluit die laaste twee stoppe).basisse) 'n kodon soos AA of GA om rekombinante plasmiede toe te laat om hul gemerkte proteïene uit te druk).Die primer-volgordes word in Tabel 1 gelys en is gesintetiseer deur Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Teikens is versterk deur gebruik te maak van Pfu DNA-polimerase (Tiangen, Beijing, China) of Ex-taq (Takara Biomediese Tegnologie [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) met behulp van voorbereide G. duodenalis cDNA as 'n sjabloon.Die eukariotiese uitdrukkingsvektorplasmied pcDNA3.1(+) is gelineariseer met beperkingsensiem EcoRV en gedefosforileer met behulp van Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Gelineariseerde pcDNA3.1(+) fragmente en geamplifiseerde teikengeen fragmente is gesuiwer deur gebruik te maak van 'n DNA gel suiwering kit (Tiangen) en gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Die pcDNA3.1(+)-fragment en elke teikengeenfragment is herkombineer met behulp van MonClone enkelsamestelling kloningmengsel (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) en bevestig deur DNA-volgordebepaling deur gebruik te maak van Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Endotoksienvrye plasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2 en pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 is gegenereer deur gebruik te maak van die SanPrep Endotoksienvrye Plasmied Mini Kit (Sangon Biotech).Die konsentrasie is bo 500 ng/µl gehandhaaf om te verseker dat die EDTA in die elueringsbuffer nie met die transfeksietoets inmeng nie.Primêre muis peritoneale makrofage is gekweek in 6-put plate met volledige RPMI 1640 medium (Biologiese Industries) vir 12 uur, daarna is die selle 3 keer in warm PBS gewas om penisillien en streptomisien te verwyder, en dan in medium aangevul met volledige medium.Endotoksienvrye plasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2 en pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 μg) is verdun in 125 μl Opti-MEM gereduseerde serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Daarna is 5 µl Lipofectamine 2000 transfekteringsreagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) verdun in 125 µl laeserum Opti-MEM medium.Berei liposoom-DNS-komplekse voor deur die verdunde endotoksienvrye plasmied met Lipofectamine 2000 te meng en die mengsel vir 5 minute by kamertemperatuur te laat staan.Dra die komplekse afsonderlik oor na selle in elke put en meng stadig.Na 4 uur is die selkultuurmedium vervang met 2 ml volledige RPMI 1640 medium en kweek is vir 24 uur voortgesit.Vars selkultuurmedium is by die selle gevoeg en vir verskeie tydpunte geïnkubeer, afhangende van die toetsontwerp.
Proteïenmonsters van supernatante en sellisate is voorberei soos voorheen beskryf [25].Membraanoordragparameters vir pro-IL-1β, pro-kaspase-1, kaspase-1 p20, NLRP3, β-aktien en His-merker was 200 mA/90 min.Vir interleukien 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, VSA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switserland) en NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switserland) en 1:5000 gerig op Sy merker ( Amylet Scientific, Wuhan, China) en β-aktien (Proteintech, Wuhan, China).
Kruisbinding met disuksinimied suberaat (DSS) is uitgevoer soos voorheen beskryf [26].Selle is 3 keer met koue PBS gewas en volledig gelys met 'n 27 gauge naald in 50 µl ASC reaksie buffer (pH 8.0) wat 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES en 125 mM NaHCO3 bevat.Die mengsel is vir 3 min by 5000 g gesentrifugeer en die korrel is vir 30 min by 37°C met 10 µl DSS (25 mM in DMSO) en 40 µl ASC-reaksiebuffer geheg.Na sentrifugering by 5000 g vir 10 minute, is die korrel opgelos in 'n oplossing van 40 µl ASC-reaksiebuffer en 10 µl 6x proteïenlaaibuffer (TransGen, Beijing, China), en dan is die oplossing by kamertemperatuur vir 15 geblus. min., Kook dan 10 minute.Proteïenmonsters is dan onderwerp aan Western blotting met behulp van primêre anti-ASC teenliggaampies (Wanleibio, Shenyang, China) teen 'n verdunningsverhouding van 1:500.
Na aanleiding van 'n voorheen beskryfde prosedure [13], is selkultuur-supernatante geoes en afskeiding van die pro-inflammatoriese sitokien IL-1β is bepaal met behulp van die muis IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Skakel OD450nm-waardes om na proteïenkonsentrasies deur die IL-1β-standaardkromme te gebruik.
Selle wat op dekstrokies bedek is, is saggies 3 keer in warm PBS gewas, in weefselselfikseermiddel (Biosharp, Beijing, China) vir 10 minute by kamertemperatuur (RT), in 0,1% Triton X-Permeabilize by 100 (verdun in PBS; Biosharp) gewas ) vir 20 minute by kamertemperatuur en blokkeer 5% beeserumalbumien (in PBS) vir 2 uur by kamertemperatuur.Selle is dan oornag by 4°C geïnkubeer met primêre teenliggaampies teen onderskeidelik ASC (1:100 verdunning) of NLRP3 (1:100 verdunning), en Cy3 gemerkte bok anti-konyn IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, VSA) of FITC-gekonjugeerde bok anti-muis IgG (1:400; Earthox) oornag by 37°C in die donker vir 1 uur.Die kerne is vir 5 minute met Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) gekleur en onder 'n fluoressensiemikroskoop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) waargeneem.
Muise is in vier groepe verdeel (n = 7 in elke groep): (i) PBS-behandelde negatiewe kontrolegroep (slegs PBS; sondevoeding 100 µl/muis PBS gevolg deur daaglikse intraperitoneale inspuiting 100 µl/muis PBS 3 uur later)., aaneenlopend vir 7 dae);(ii) negatiewe kontrolegroep behandel met MCC950 inhibeerder [27] (100 µl/muis via PBS sondevoeding, 3 uur later, 10 mg/kg liggaamsgewig [BW] MCC950 [in PBS] is daagliks intraperitoneaal toegedien, duur 7 dae);(iii) G. duodenalis sist infeksie groep (1,5 x 106 siste/muis deur sondevoeding, 3 uur later, 100 μl/muis PBS daagliks intraperitoneaal toegedien vir 7 dae);(iv) G. duodenalis siste gekombineerde infeksie groep MCC950 inhibeerder behandeling groep (1.5×106 siste/muis via sonde, 10mg/kg liggaamsgewig MCC950 daagliks intraperitoneaal vir 7 dae op 3h).Die liggaamsgewig van elke muis is daagliks gemonitor en alle muise is op die 7de dag doodgemaak.Geoesde duodenum (3 cm lank) is in klein stukkies gesny in 1 ml PBS, siste is oornag in PBS by 4°C vernietig, en G. duodenalis trophozoites.Vars duodenum (1 cm lank) is geïsoleer vir hematoksilien en eosien (H&E) kleuring.
Muise is in twee groepe verdeel: (i) MOCK kontrole groep en (ii) MCC950 inhibeerder groep.Daar was vyf behandelings in elke groep (n = 7/behandelingsgroep): (i) PBS-behandeling negatiewe kontrolegroep (slegs PBS; 100 µl/muis PBS, binnespierse (IM) inspuiting (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmied-negatiewe kontrolegroep (100 µg/muis-DNA, via intramuskulêre inspuiting) (iii) G. duodenalis sist infeksie positiewe kontrolegroep (1.5 x 106 siste/muis, via sondevoeding) (iv) a); groep behandel met plasmied pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/muis-DNA, deur binnespierse inspuiting), en (v) 'n groep behandel met plasmied pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/muis) DNA, na 12 uur se deurgang, het muise in die MCC950-remmergroep 'n daaglikse intraperitoneale inspuiting van MCC950 (10 mg/kg liggaamsgewig) vir 7 dae ontvang, terwyl muise in die MOCK-groep 'n gelyke volume PBS-behandeling ontvang het. Bloedmonsters is versamel van die oogballe muise en oornag gelaat by 4 ° C Serum monsters is geïsoleer met behulp van ensiem-gekoppelde immunosorbent toets (ELISA) vir en metings van IL-1β vlakke.
Vyf-en-dertig muise is in vyf groepe verdeel (n=7/groep).Groep 1 was 'n negatiewe kontrolegroep wat met PBS behandel is: muise het 100 μl PBS binnespiers ontvang en 3 dae later deur sondevoeding.Groep 2 is 'n positiewe kontrolegroep wat met G. duodenalis siste besmet is: muise is met 100 μl PBS ingespuit, en 3 dae later is 1.5 x 106 siste/muis intragastries ingespuit.Derde groep – plasmied-immunisering met pcDNA3.1(+) in kombinasie met 'n kontrolegroep vir duodenale sistinfeksie: muise het 100 μg plasmied DNA pcDNA3.1(+)(im) oraal ontvang, 1.5×106 siste/muis 3 vir verskeie dae.Groepe 4 en 5 was rekombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardienplasmied of pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardienplasmied in kombinasie met G. duodenalis sist infeksie.Eksperimentele groep: muise het 100 µg pcDNA3 ontvang.1(+)-giardine plasmied DNA (im), dan 3 dae later, is 1,5 × 106 siste/muis ingespuit via sondevoeding.Die liggaamsgewig van elke muis is gemonitor na die bekendstelling van die G. duodenalis sist deur die buis.Vars duodenum is versamel vir parasitiese ladingmetings en HE-kleuringsanalise.
Histopatologiese veranderinge is ontleed volgens 'n voorheen gepubliseerde prosedure [30].Vars duodenum is met weefselselfikseermiddel gefixeer, in paraffien ingebed, in 4 μm snitte gesny, met H&E gekleur en onder 'n ligmikroskoop ontleed.Verteenwoordigende patologiese veranderinge in sewe weefselafdelings van sewe onafhanklike muise is geëvalueer deur 'n patoloog wat nie bewus was van die behandeling nie en is met 200x vergroting vasgevang.Die lengte van die villi en die diepte van die kripte is gemeet in ooreenstemming met die voorheen beskryf metodes.
Die resultate in vitro en in vivo is in drievoud verkry.Grafieke is gegenereer met behulp van GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, VSA).Verskille tussen twee groepe is deur t-toets ontleed, terwyl verskille tussen ≥3 groepe ontleed is deur eenrigting-variansieanalise (ANOVA) met behulp van SPSS sagteware (weergawe 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, VSA).Data is ontleed vir homogeniteit van variansie met behulp van Levene se toets gevolg deur Bonferroni se post hoc toets (B).Betekenis word uitgedruk as P<0.05, P<0.01 en P<0.001 (nie betekenisvol [ns]) (P>0.05).
Ons vorige ontleding van GEV-proteomika in die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) het getoon dat baie teikens betrokke kan wees by die aktivering van inflammatoriese seinweë [13].Ons het twee belowende teikens, alfa-2 en alfa-7.3 giardiene gekies, hierdie molekules versterk en gebruik om die pcDNA3.1(+) eukariotiese uitdrukkingsvektor te konstrueer.Na volgordebepaling is rekombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 en alfa-7.3 giardine-uitdrukkingsplasmiede in primêre muis peritoneale makrofage getransfekteer, en die caspase-1 p20-handtekeningproteïen van inflammasie ('n fragment van geaktiveerde caspase-1) is geïdentifiseer as toeligting van sleutelmolekules wat inflammasie kan veroorsaak.Die resultate het getoon dat alfa-2 en alfa-7.3 giardines p20 kaspase-1 uitdrukking soortgelyk aan GEV kan induseer.Geen effek op kaspase-1-aktivering is gevind in die onbehandelde negatiewe kontrole (slegs PBS) en plasmiedkontrole pcDNA3.1(+) (Figuur 1).
Meting van p20 kaspase-1 aktivering deur pcDNA3.1(+)-alfa-2 en alfa-7.3 giardins.Rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2 en alfa-7.3 giardines (bo elke baan) is in primêre muis peritoneale makrofage getransfekteer en kultuursupernatante is 24 uur later geoes.Western blotting is gebruik om uitdrukkingsvlakke van die kenmerkende caspase-1 p20 inflammasoomproteïen te meet.Die PBS-enigste behandelingsgroep (baan C) en die pcDNA3.1(+) monoterapiegroep (pcDNA3.1 baan) is as 'n negatiewe kontrole gebruik, en die GEV-behandelingsgroep is as 'n positiewe kontrole gebruik.Uitdrukking van die rekombinante proteïen is bevestig deur 'n histidienmerker in elke proteïen op te spoor, en die verwagte proteïenbande was alfa-2-giardien (38.2 kDa) en alfa-7.3-giardien (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum ekstrasellulêre vesikels, pcDNA3.1(+), EcoRV-gelineariseerde vektor, SUP, supernatant
Om te bepaal of alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien p20-kaspase-1-uitdrukking induseer en 'n rol speel in die aktivering van die gasheer NLRP3-inflammatoriese respons, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardine en pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin is getransfekteer in primêre muis peritoneale makrofage met rekombinante plasmied DNA, en vlakke van uitdrukking, lokalisering en oligomerisering van die sleutel inflammatoriese proteïene NLRP3 is bepaal.In hierdie eksperiment is GEV as die positiewe kontrole groep gebruik, en die geen behandeling groep (slegs PBS) of die pcDNA3.1(+) transfeksie behandeling groep was die negatiewe groep.Die resultate het getoon dat, soos in die GEV-groep, rekombinante plasmied DNA van giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 en giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 gelei het tot opregulering van NLRP3, pro-IL-1β en procaspase-1 en caspase-1 aktivering (Fig. 2a).Daarbenewens het beide giardiene beduidende IL-1β-afskeiding geïnduseer (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2-giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardien: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figuur 2b).Die meeste ASC-proteïene was monomeer in die geen-behandelingsgroep of in die behandelingsgroep wat met die pcDNA3.1(+)-plasmied getransfekteer is, in teenstelling met pcDNA3.1(+)-alfa-2 of pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardine.ASC-oligomerisasie het plaasgevind in die rekombinante plasmied DNA van die GEV positiewe kontrole groep of groep, wat 'n oligomere vorm toon (Figuur 2c).Hierdie voorlopige data dui daarop dat alfa-2-giardien en alfa-7,3-giardien NLRP3-inflammasie-aktivering kan veroorsaak.Daaropvolgende immunofluorescerende studies van die lokalisering van ASC en NLRP3 het getoon dat in die negatiewe kontrolegroep, die ASC-proteïen deur die sitoplasma verstrooi was en as 'n puntsein verskyn het by stimulasie van pcDNA3.1(+)-alfa-2 met giardine of pcDNA3.1(+)-alfa-7,3-giardiengroep of GEV positiewe kontrolegroep (Figuur 2d).In die negatiewe kontrole en plasmied-behandelde pcDNA 3.1-groepe is die NLRP3-proteïensein nie opgespoor nie, terwyl 'n fluoresserende seinkol in reaksie op pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardine of pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 bespeur is..giardine word gevind in die sitoplasma of tydens stimulasie van die HEV (Fig. 2e).Hierdie data demonstreer verder dat G. duodenalis giardin alfa-2 en giardin alfa-7.3 die NLRP3 inflammasoom in muis primêre peritoneale makrofage aktiveer.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin en pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktiveer die NLRP3 inflammasoom in muis peritoneale makrofage.Transfekteer die rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin en pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin in primêre muriene peritoneale makrofage en selle, of oes die supernatant binne 24 uur vir ontleding van uitdrukking, oligomerisering , afskeiding.en lokalisering van sleutel inflammatoriese proteïene.Die PBS-enigste (C) groep en die pcDNA3.1(+) enkelbehandelingsgroep is as die negatiewe kontrole gebruik, en die GEV-behandelingsgroep is as die positiewe groep gebruik.a Sleutel inflammatoriese proteïene NLRP3, insluitend NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 en p20 caspase-1, is opgespoor deur Western blotting.b Die vlakke van afskeiding van IL-1β in die supernatante is bepaal deur gebruik te maak van ensiemgekoppelde immunosorbenttoets (ELISA).Verskille tussen kontrole- en eksperimentele groepe is ontleed deur eenrigting-variansieanalise (ANOVA) met behulp van SPSS sagteware weergawe 22.0.Sterretjies dui beduidende verskille tussen groepe **P<0.01 en ***P<0.001 aan.c ASC-oligomerisasievlakke in korrels is deur DSS-kruisbindingsanalise bepaal, terwyl ASC-vlakke in selliste as 'n laaikontrole gebruik is.d Visualisering van ISC-lokalisering met behulp van immunofluoressensie.e Immunofluoressensie is gebruik om die lokalisering van NLRP3 te visualiseer.ASC, apoptotiese spikkelagtige proteïen;IL, interleukien;NLRP3, nukleotied-bindende oligomerisering-agtige reseptor 3;ns, nie betekenisvol nie (P > 0,05)
Beide G. duodenalis en die GEV's wat dit afskei aktiveer die NLRP3 inflammasoom en reguleer gasheer inflammatoriese response in vitro.Die rol van die NLRP3-inflammasoom in die patogenisiteit van G. duodenalis bly dus onduidelik.Om hierdie kwessie te ondersoek, het ons 'n eksperiment ontwerp tussen muise wat met G. duodenalis-sist besmet is en muise wat met G. duodenalis-sist + MCC950-inhibeerderbehandeling besmet is en NLRP3-inflammasoomuitdrukking vergelyk wanneer dit met G. duodenalis-sist besmet is.'n Gedetailleerde skema van die eksperiment word in Fig. 3a getoon.Veranderinge in liggaamsgewig van muise in verskillende behandelingsgroepe is gemonitor vir 7 dae na infeksie met siste, en die resultate word in Fig. 3b getoon.In vergelyking met die groep wat met suiwer PBS behandel is, het die resultate getoon dat (i) die liggaamsgewig van muise wat met G. duodenalis-sist besmet is, vanaf dag 3 tot dag 7 na infeksie afgeneem het;(ii) behandeling met die MCC950 inhibeerder het geen betekenisvolle effek op die liggaamsgewig van die muise gehad nie..In vergelyking met die enkele infeksiegroep, het die BW van die duodenale infeksiegroep wat met MCC950 behandel is tot verskillende grade afgeneem (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dag 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dag 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175;Hierdie data demonstreer dat die NLRP3-inflammasoom muise beskerm teen aansienlike gewigsverlies in die vroeë stadiums (2-4 dae) van duodenale infeksie.Ons het daarna gemik om G. duodenalis trophozoites in duodenale spoelvloeistof op te spoor en die resultate word in Figuur 3c getoon.In vergelyking met die G. duodenalis sist infeksie groep, het die aantal trofosoïete in die duodenum aansienlik toegeneem na blokkering van die NLRP3 inflammasoom (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenale weefsels wat met HE gekleur is, het in vergelyking met negatiewe kontrole behandel met PBS en MCC950 alleen getoon: (i) G. duodenalis sist infeksie het gelei tot skade aan die duodenale villi (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488 ) en kriptatrofie (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum van muise wat met G. duodenalis-siste besmet is en met MCC950-inhibeerders behandel is.duodenale villi is beskadig en dood (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) met atrofie en kriptvertakking (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Hierdie resultate dui daarop dat die NLRP3 inflammasoom 'n rol speel in die vermindering van die patogenisiteit van G. duodenalis.
Rol van NLRP3 inflammasoom in Giardia duodenum infeksie.Muise is met sondes (iv) met duodenokokkale siste behandel en dan met of sonder MCC950 (ip) behandel.Enkelbehandelingsgroepe met PBS of MCC950 is as kontroles gebruik.Eksperimentele groep en behandelingsregime.b Die liggaamsgewig van muise in elk van die verskillende behandelingsgroepe is vir 7 dae gemonitor.Die verskil tussen die G. duodenalis infeksie groep en die G. duodenalis + MCC950 infeksie behandeling groep is ontleed deur t-toets met behulp van SPSS sagteware weergawe 22.0.Sterretjies dui beduidende verskille by *P<0.05, **P<0.01 of ***P<0.001 aan.c Parasitiese lading is bepaal deur die aantal trofosoïete in duodenale spoelvloeistof te tel.Die verskil tussen die G. duodenalis infeksie groep en die G. duodenalis + MCC950 infeksie behandeling groep is ontleed deur t-toets met behulp van SPSS sagteware weergawe 22.0.Sterretjies dui beduidende verskille by *P < 0,05 aan.d Hematoksilien en eosien (H&E) kleuringsresultate van duodenale histopatologie.Rooi pyle dui skade aan die villi aan, groen pyle dui skade aan die kripte aan.Skaalbalk: 100 µm.e, f Statistiese ontleding van duodenale villus hoogte en muis krip hoogte.Sterretjies dui beduidende verskille by *P<0.05 en **P<0.01 aan.Die resultate is geneem uit 7 onafhanklike biologiese eksperimente.BW, liggaamsgewig;ig, intragastriese afleweringsroete;ip, intraperitoneale afleweringsroete;ns, nie betekenisvol nie (P > 0,05);PBS, fosfaatgebufferde soutoplossing;WT, wilde tipe
Die afskeiding van IL-1β is 'n kenmerk van inflammasieaktivering.Om te bepaal of G. duodenalis alfa-2 giardine en alfa-7.3 giardine die NLRP3 gasheer inflammasoom in vivo aktiveer, het ons onbehandelde WT muise (skyngroep) en NLRP3 inflammasoom-geblokkeerde muise (MCC950 geïnhibeerde behandelingsgroep) gebruik.'n Gedetailleerde skema van die eksperiment word in Fig. 4a getoon.Eksperimentele groepe het bestaan ​​uit muise behandel met PBS, G. duodenalis sist behandeling deur sondevoeding, binnespierse inspuiting van pcDNA3.1 en binnespierse inspuiting van pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine of pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine.Op die 7de dag na binnespierse toediening van die rekombinante plasmied, is serum versamel en die vlak van IL-1β in elke groep is bepaal.Soos getoon in Figuur 4b, in die MOCK-groep: (i) in vergelyking met die PBS-groep, het pcDNA3.1-behandeling geen betekenisvolle effek op IL-1β-afskeiding gehad nie (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), egter, IL-β afskeiding was betekenisvol verhoog in die G. duodenalis siste groep (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardine en pcDNA3.1- Binnespierse inspuiting van alfa-7.3 giardien het serum IL-1β vlakke aansienlik verhoog (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3-giardien het hoë vlakke van IL-1β-afskeiding geïnduseer in die pcDNA3.1-alfa-2-giardien binnespierse inspuitingsgroep (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .In vergelyking met elke groep in die MCC950-behandelingsgroep en die MOCK-groep: (i) IL-1β-afskeidingsvlakke in die PBS-kontrolegroep en die pcDNA3.1-kontrolegroep het tot 'n sekere mate afgeneem nadat die MCC950-remmer geblokkeer is, maar die verskil was nie betekenisvol (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) nadat MCC950 geblokkeer is., is IL-1β-afskeiding aansienlik verminder in die G. duodenalis sist-geïnfekteerde groep, die pcDNA3.1-alfa-2-giardiengroep en die pcDNA3.1-alfa-7.3-giardiengroep (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA 5, F(9; ) = 3,540, P = 0,0164).Hierdie resultate dui daarop dat alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien die aktivering van die NLRP3-inflammasoom in vivo bemiddel.
pcDNA3.1(+)-giardines aktiveer die NLRP3-gasheer-inflammasoom in vivo.Muise is geïmmuniseer (IM) met rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmied pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardine of pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardine en dan behandel met MCC950 (ip; MCC950-groep) of nie (blootgroepgroep) ).Die PBS of pcDNA3.1(+) plasmied behandelingsgroep is as 'n negatiewe kontrole gebruik, die G. duodenalis sist behandelingsgroep is as 'n positiewe kontrole gebruik.Eksperimentele groep en behandelingsregime.b Serumvlakke van IL-1β in muise is op dag 7 deur ELISA-toets gemeet.Verskille tussen groepe in die MOCK-groep is ontleed met behulp van eenrigting ANOVA, en verskille tussen die MOCK-groep en die MCC950-groep is ontleed met behulp van die t-toets van SPSS sagteware weergawe 22.0.Sterretjies dui beduidende verskille aan tussen behandelingsgroepe in die MOCK-groep, *P<0.05 en ***P<0.001;dollartekens ($) dui beduidende verskille aan tussen elke groep in die MOCK-groep en die MCC950-groep by P<0.05.Resultate van sewe onafhanklike biologiese eksperimente.i, binnespierse inspuiting, ns, nie betekenisvol nie (P > 0.05)
Om die effek van alfa-2- en alfa-7.3-giardien-gemedieerde aktivering van die NLRP3-gasheer-inflammasoom op G. duodenalis-infektiwiteit te ondersoek, het ons WT C57BL/6-muise gebruik en alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien ingespuit.die plasmied is binnespiers ingespuit, na 3 dae deur die maagbuis van die G. duodenalis sist, waarna die muise vir 7 dae waargeneem is.'n Gedetailleerde skema van die eksperiment word in Fig. 5a getoon.Die liggaamsgewig van elke muis is elke dag gemeet, monsters van vars duodenale weefsel is op die 7de dag na toediening deur 'n maagbuis versamel, die aantal trofosoïete is gemeet en histopatologiese veranderinge is waargeneem.Soos getoon in Figuur 5b, met toenemende voedingstyd, het die BW van muise in elke groep geleidelik toegeneem.Die MT van muise het begin afneem op die 3de dag na intragastriese toediening van G. duodenalis siste, en dan geleidelik toegeneem.Aktivering van die NLRP3-inflammasoom geïnduseer deur binnespierse inspuiting van alfa-2-giardien en alfa7.3-giardien het gewigsverlies in muise aansienlik verswak (Dag 1: pcDNA3.1-alfa-2-giardien, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Dag 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dag 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Dag 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Dag 4: pcDNA3.1-alfa-2 giard , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dag 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Dag 6: pcDNA3. alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dag 6: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Dag 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).Die parasitiese lading is in die duodenum geassesseer (Fig. 5c).In vergelyking met die onbehandelde positiewe kontrole en die groep wat met die leë pcDNA3.1-vektor ingespuit is, is die aantal G. duodenalis trophozoites aansienlik verminder in die groepe wat met α-2-giardien en α-7,3-giardien (pcDNA3.1-alfa) ingespuit is. -2 giardien: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardien: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Daarbenewens was giardine alfa-7.3 meer beskermend in muise as giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Die resultate van HE-kleuring word in fig.5d-f.Muise wat met alfa-2-giardine en alfa-7.3-giardine ingespuit is, het minder duodenale weefselletsels gehad, gemanifesteer deur villusskade, in vergelyking met muise wat met G. duodenalis ingespuit is en muise wat met G. duodenalis ingespuit is in kombinasie met 'n leë pcDNA3 vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 of P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 of P = 0,0055) en verminderde kriptatrofie (pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 of P = 0.0158; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA giardine , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 of P = 0,0191).Hierdie resultate dui daarop dat alfa-2-giardien en alfa-7,3-giardien die infektiwiteit van G. duodenalis verminder deur die NLRP3-inflammasoom in vivo te aktiveer.
Rol van pcDNA3.1(+)-giardins in G. duodenalis infeksie.Muise is geïmmuniseer (IM) met rekombinante eukariotiese uitdrukkingsplasmiede pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardien of pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardien en dan met G. duodenalis-siste (ig) uitgedaag.Die PBS-groep en die pcDNA3.1(+) + duodenale siste-behandelingsgroep is as negatiewe kontrolegroepe gebruik, en die duodenale sist-behandelingsgroep is as positiewe kontrolegroep gebruik.Eksperimentele groep en behandelingsregime.b Die MT van muise in elk van die verskillende behandelingsgroepe is vir 7 dae na-uitdaging gemonitor.Sterretjies dui beduidende verskille aan tussen groepe in die G. duodenalis-groep en die pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiengroep, *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001;die dollarteken ($) dui op 'n beduidende verskil tussen elke groep G. duodenalis en die pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-jardinegroep, $$P<0.01 en $$$P<0.001.c Parasitiese lading is bepaal deur die aantal trofosoïete in 1 ml duodenale spoeling vanaf die duodenum (3 cm lank) te tel en uitgedruk as die aantal parasiete per cm duodenum.Verskille tussen die G. duodenalis infeksiegroep, die pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardiengroep en die pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardiengroep is deur eenrigting ANOVA met SPSS-sagteware weergawe 22.0 ontleed.Sterretjies dui beduidende verskille by **P<0.01 en ***P<0.001 aan.d Histopatologiese veranderinge in die duodenum.Rooi pyle dui skade aan die villi aan, groen pyle dui skade aan die kripte aan.Skaalbalk: 100 µm.e, f Statistiese ontleding van muis duodenale villus hoogte (e) en krip hoogte (f).Verskille tussen groepe in Figuur 1d is ontleed deur eenrigting ANOVA met SPSS sagteware weergawe 22.0.Sterretjies dui beduidende verskille by *P<0.05 en **P<0.01 aan.Resultate van sewe onafhanklike biologiese eksperimente.ns, nie betekenisvol nie (P > 0,05)
Giardia duodenum is 'n bekende dermparasiet van mense en ander soogdiere wat giardiasis veroorsaak.In 2004 is dit ingesluit in die WGO se inisiatief vir verwaarloosde siektes as gevolg van die hoë voorkoms daarvan oor 6 jaar, veral in gemeenskappe met lae sosio-ekonomiese status [32].Die aangebore immuunstelsel speel 'n kritieke rol in die immuunrespons op G. duodenalis infeksie.Daar is gerapporteer dat muismakrofage G. duodenalis verswelg en doodmaak deur ekstrasellulêre lokvalle vry te stel [33].Ons vorige studies het getoon dat G. duodenalis, 'n nie-indringende ekstrasellulêre parasiet, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, en NLRP3 inflammatoriese seinweë in muismakrofage aktiveer om gasheer inflammatoriese response te reguleer, en vrygestelde GEV kan hierdie proses verbeter.13], 24].Die presiese PAMPs betrokke by NLRP3-inflammasoom-gereguleerde inflammasie in GEV en die rol van NLRP3-inflammasoom in giardiasis moet egter nog toegelig word.Om lig op hierdie twee vrae te werp, het ons hierdie studie uitgevoer.
Die NLRP3-inflammasoom is in die sitoplasma van immuunselle geleë en kan deur verskeie deeltjies soos uriensuurkristalle, gifstowwe, bakterieë, virusse en parasiete geaktiveer word.In bakteriese studies is gifstowwe geïdentifiseer as sleutel PAMP's wat inflammatoriese sensors aktiveer, wat lei tot inflammasie en seldood [34].Sommige struktureel diverse gifstowwe, soos hemolisien van Staphylococcus aureus [35] en Escherichia coli [36], hemolisien BL (HBL) van enterotoksien (NHE) [37], veroorsaak die aktivering van NLRP3-ontsteking.Virale studies het getoon dat virulensieproteïene soos SARS-COV-2-omhulsel (E)-proteïen [38] en Zika-virus NS5-proteïen [39] belangrike PAMPs is wat deur die NLRP3-reseptor herken word.In parasietstudies is berig dat baie parasiete geassosieer word met gasheer-inflammasoomaktivering, soos Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] en Leishmania [42].Die digte korrelproteïene GRA35, GRA42 en GRA43, geassosieer met die virulensie van Toxoplasma gondii, word benodig vir die induksie van piroptose in Lewis-rotmakrofage [43].Daarbenewens het sommige Leishmania-studies gefokus op individuele molekules wat betrokke is by die NLRP3-inflammasoom, soos parasietmembraanlipofosfoglikaan [44] of sinkmetalloprotease [45].Onder die anneksien-agtige alfa-giardin familie van gene, is getoon dat alfa-1 giardin 'n potensiële entstofkandidaat is wat beskerming bied teen G. duodenalis in 'n muismodel [18].In ons studie het ons G. duodenalis virulensiefaktore alfa-2 en alfa-7,3 giardines gekies, wat uniek is aan giardia maar relatief minder gerapporteer is.Hierdie twee teikengene is in die pcDNA3.1(+) eukariotiese uitdrukkingsisteemvektor gekloneer vir ontleding van inflammasieaktivering.
In ons muismodel dien gekloofde kaspasefragmente as merkers van inflammatoriese aktivering.By stimulasie tree NLRP3 in wisselwerking met ASC, werf procaspases en genereer aktiewe caspases wat pro-IL-1β en pro-IL-18 in volwasse IL-1β en IL-18, onderskeidelik -18, splits.Inflammatoriese kaspases (kaspases-1, -4, -5 en -11) is 'n bewaarde familie van sisteïenproteases wat van kritieke belang is vir aangebore verdediging en betrokke is by inflammasie en geprogrammeerde seldood [46].Caspase-1 word geaktiveer deur kanoniese inflammasome [47], terwyl kaspases-4, -5 en -11 tydens die vorming van atipiese inflammasome [48] gesplits word.In hierdie studie het ons muis peritoneale makrofage as 'n model gebruik en p20 kaspase-1 gekloofde kaspase-1 ondersoek as 'n merker van gasheer NLRP3 inflammasie aktivering in studies van G. duodenalis infeksie.Die resultate het getoon dat baie alfa-giardiene verantwoordelik is vir die tipiese aktivering van inflammasie, wat ooreenstem met die ontdekking van sleutelvirulensiemolekules betrokke by bakterieë en virusse.Ons studie is egter slegs 'n voorlopige skerm en daar is ander molekules wat nie-klassieke inflammasome kan aktiveer, aangesien ons vorige studie beide klassieke en nie-klassieke inflammasome in G. duodenalis-infeksie gevind het [13].Om verder te bepaal of die gegenereerde p20-kaspase-1 met die NLRP3-inflammasoom geassosieer word, het ons alfa-2- en alfa-7.3-giardiene in muis peritoneale makrofage getransfekteer om sleutelmolekule-proteïenuitdrukkingsvlakke en ASC-oligomerisasievlakke te bepaal, wat bevestig dat beide α-giardiene aktiveer inflammasie NLRP3.Ons resultate verskil effens van dié van Manko-Prykhoda et al., wat berig het dat stimulasie van Caco-2-selle met G. muris of E. coli EPEC-stamme alleen die fluoressensie-intensiteit van NLRP3, ASC en caspase-1 kan verhoog, hoewel nie beduidend nie, terwyl hoe ko-stimulasie van G. muris en E. coli die vlakke van drie proteïene verhoog het [49].Hierdie verskil kan wees as gevolg van verskille in die seleksie van Giardia spesies, sellyne en primêre selle.Ons het ook in vivo toetse uitgevoer met behulp van MCC950 in 5-week-oue vroulike WT C57BL/6 muise, wat meer vatbaar is vir G. duodenalis.MCC950 is 'n kragtige en selektiewe kleinmolekule NLRP3-inhibeerder wat kanoniese en nie-kanoniese NLRP3-aktivering by nanomolêre konsentrasies blokkeer.MCC950 inhibeer NLRP3-aktivering, maar beïnvloed nie die aktivering van AIM2-, NLRC4- en NLRP1-inflammatoriese weë of TLR-seinpaaie nie [27].MCC950 blokkeer NLRP3-aktivering maar inhibeer nie NLRP3-inisiasie, K+-uitvloei, Ca2+-invloei of die interaksie tussen NLRP3 en ASC nie;in plaas daarvan inhibeer dit NLRP3-inflammasoomaktivering deur ASC-oligomerisasie te blokkeer [27].Daarom het ons MCC950 in 'n in vivo studie gebruik om die rol van die NLRP3 inflammasoom na giardien inspuiting te bepaal.Geaktiveerde caspase-1 p10 klief pro-inflammatoriese sitokiene pro-IL-1β en pro-IL-18 in volwasse IL-1β en IL-18 [50].In hierdie studie is serum IL-1β vlakke in giardien-behandelde muise met of sonder MCC950 gebruik as 'n aanduiding van of die NLRP3 inflammasoom geaktiveer is.Soos verwag, het MCC950-behandeling die serum IL-1β-vlakke aansienlik verminder.Hierdie data demonstreer duidelik dat G. duodenalis giardin alfa-2 en giardin alfa-7.3 in staat is om die NLRP3 muis inflammasoom te aktiveer.
Beduidende data wat oor die afgelope dekade opgehoop is, het getoon dat IL-17A die meesterreguleerder van immuniteit teen G. muris is, wat IL-17RA-sein induseer, antimikrobiese peptiede produseer en komplementaktivering reguleer [51].Giardia-infeksie kom egter meer gereeld by jong volwassenes voor, en dit is gerapporteer dat Giardia-infeksie by jong muise nie die IL-17A-reaksie aktiveer om sy beskermende effek uit te oefen nie [52], wat navorsers aangespoor het om na ander immunomodulerende Giardia te soek.meganismes van helminth infeksie.Die skrywers van 'n onlangse studie het berig dat G. muris die NLRP3-inflammasoom deur E. coli EPEC kan aktiveer, wat die produksie van antimikrobiese peptiede bevorder en die aanhegtingsvermoë daarvan en die aantal trofosoïete in die dermkanaal verminder, en sodoende die erns van kolon verminder siektes wat veroorsaak word deur basille [49].Die NLRP3-inflammasoom is betrokke by die ontwikkeling van verskeie siektes.Studies het getoon dat Pseudomonas aeruginosa outofagie in makrofage veroorsaak om seldood te vermy, en hierdie proses hang af van die aktivering van die NLRP3-inflammasoom [53].Vir N. caninum beperk reaktiewe suurstofspesie-gemedieerde aktivering van die NLRP3-inflammasoom sy replikasie in die gasheer, wat dit 'n potensiële terapeutiese teiken maak [9].Daar is gevind dat Paracoccidioides brasiliensis die aktivering van die NLRP3-inflammasoom in muisbeenmurg-afgeleide dendritiese selle veroorsaak, wat lei tot die vrystelling van die inflammatoriese sitokien IL-1β, wat 'n kritieke rol in gasheerverdediging speel [10].Verskeie Leishmania spesies, insluitend L. amazonensis, L. major, L. braziliensis en L. infantum chagasi, aktiveer NLRP3 en ASC-afhanklike caspase-1 in makrofage, asook Leishmania infeksie.Parasietreplikasie word verbeter in muise met 'n tekort aan die NLRP3/ASC/caspase-1 geen [11].Zamboni et al.Daar is gerapporteer dat Leishmania-infeksie aktivering van die NLRP3-inflammasoom in makrofage veroorsaak, wat intrasellulêre parasietreplikasie beperk.Leishmania kan dus NLRP3-aktivering as 'n vermydingstrategie inhibeer.In in vivo studies het die NLRP3 inflammasoom bygedra tot die uitskakeling van Leishmania, maar het nie weefsels beïnvloed nie [54].Omgekeerd, in helminthiasis-studies, het aktivering van die NLRP3-inflammasoom die gasheer se beskermende immuniteit teen gastro-intestinale helmintiasis onderdruk [12].Shigella is een van die hoofbakterieë wat diarree wêreldwyd veroorsaak.Hierdie bakterieë kan IL-1β-produksie veroorsaak deur P2X7-reseptor-gemedieerde K+ uitvloei, reaktiewe suurstofspesies, lisosomale versuring en mitochondriale skade.Die NLRP3-inflammasoom reguleer negatief fagositose en bakteriedodende aktiwiteit van makrofage teen Shigella [55].Plasmodium-studies het getoon dat AIM2-, NLRP3- of caspase-1-tekorte muise wat met Plasmodium besmet is, hoë vlakke van tipe 1-interferon produseer en meer bestand is teen Plasmodium-infeksie [56].Die rol van alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien om patogeniese aktivering van NLRP3-ontsteking by muise te veroorsaak, is egter onduidelik.
In hierdie studie het inhibisie van die NLRP3-inflammasoom deur MCC950 BW verminder en die aantal trofosoïete in dermspoelvloeistof in muise verhoog, wat tot meer ernstige patologiese veranderinge in duodenale weefsel gelei het.Alfa-2-giardien en alfa-7.3-giardien aktiveer die gasheermuis NLRP3-inflammasoom, verhoog muisliggaamsgewig, verminder die aantal trofosoïete in dermspoelvloeistof en verlig patologiese duodenale letsels.Hierdie resultate dui daarop dat G. duodenalis die NLRP3 gasheer inflammasoom kan aktiveer via alfa-2 giardine en alfa-7,3 giardine, wat die patogenisiteit van G. duodenalis in muise verminder.
Gesamentlik demonstreer ons resultate dat alfa-2 en alfa-7.3 giardines die aktivering van die NLRP3 gasheer inflammasoom induseer en die infektiwiteit van G. duodenalis in muise verminder.Daarom is hierdie molekules belowende teikens vir die voorkoming van giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: 'n oorsig.Dit is onlangs aan die lig gebring dat Pat Inflamm allergies is vir dwelms.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: 'n oorsig van farmakoterapie.Deskundige opinie van 'n apteker.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, middelweerstand en die ontdekking van nuwe teikens.Infekteer Disord dwelm teikens.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ens NLRP3 inflammatoriese en inflammatoriese siektes.Oksied Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Die rol van die inflammasoom in dermontsteking en kanker.Gastroënterologie.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanoniese en atipiese NLRP3-inflammasoomaktivering by die kruispad van immuunverdraagsaamheid en dermontsteking.pre-immuun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-gemedieerde NLRP3 inflammasoom aktivering is betrokke in reaksie op N. caninum infeksie.Parasiet vektor.2020;13:449.