Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Geenvektore vir die behandeling van pulmonale sistiese fibrose moet op die geleidende lugweë gerig word, aangesien perifere longtransduksie geen terapeutiese effek het nie.Die doeltreffendheid van virale transduksie is direk verwant aan die verblyftyd van die draer.Afleweringsvloeistowwe soos geendraers diffundeer egter natuurlik in die alveoli tydens inaseming, en terapeutiese deeltjies van enige vorm word vinnig deur mukosiliêre vervoer verwyder.Die verlenging van die verblyftyd van geendraers in die respiratoriese kanaal is belangrik, maar moeilik om te bereik.Draer-gekonjugeerde magnetiese deeltjies wat na die oppervlak van die respiratoriese kanaal gerig kan word, kan plaaslike teikening verbeter.As gevolg van probleme met in vivo beelding, word die gedrag van sulke klein magnetiese deeltjies op die lugwegoppervlak in die teenwoordigheid van 'n toegepaste magneetveld swak verstaan.Die doel van hierdie studie was om sinchrotronbeelding te gebruik om in vivo die beweging van 'n reeks magnetiese deeltjies in die tragea van verdoofde rotte te visualiseer om die dinamika en gedragspatrone van enkel- en grootmaatdeeltjies in vivo te bestudeer.Ons het dan ook beoordeel of aflewering van lentivirale magnetiese deeltjies in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld die doeltreffendheid van transduksie in die rotlugpyp sal verhoog.Sinchrotron X-straalbeelding toon die gedrag van magnetiese deeltjies in stilstaande en bewegende magnetiese velde in vitro en in vivo.Deeltjies kan nie maklik met magnete oor die oppervlak van lewende lugweë gesleep word nie, maar tydens vervoer word afsettings gekonsentreer in die gesigsveld, waar die magneetveld die sterkste is.Transduksiedoeltreffendheid is ook sesvoudig verhoog wanneer lentivirale magnetiese deeltjies in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld afgelewer is.Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat lentivirale magnetiese deeltjies en magnetiese velde waardevolle benaderings kan wees om geenvektor-teikening en transduksievlakke in die geleidende lugweë in vivo te verbeter.
Sistiese fibrose (CF) word veroorsaak deur variasies in 'n enkele geen genaamd die CF transmembraangeleidingsreguleerder (CFTR).Die CFTR-proteïen is 'n ioonkanaal wat teenwoordig is in baie epiteelselle regdeur die liggaam, insluitend die lugweë, 'n belangrike plek in die patogenese van sistiese fibrose.Defekte in CFTR lei tot abnormale watervervoer, dehidrasie van die lugwegoppervlak en verminderde lugwegoppervlakvloeistoflaag (ASL) diepte.Dit benadeel ook die vermoë van die mukosiliêre vervoerstelsel (MCT) om die lugweë van ingeasemde deeltjies en patogene skoon te maak.Ons doelwit is om 'n lentivirale (LV) geenterapie te ontwikkel om die korrekte kopie van die CFTR-geen te lewer en ASL-, MCT- en longgesondheid te verbeter, en om voort te gaan met die ontwikkeling van nuwe tegnologieë wat hierdie parameters in vivo1 kan meet.
LV vektore is een van die voorste kandidate vir sistiese fibrose geenterapie, hoofsaaklik omdat hulle die terapeutiese geen permanent in lugwegbasale selle (lugwegstamselle) kan integreer.Dit is belangrik omdat hulle normale hidrasie en slymopruiming kan herstel deur te differensieer in funksionele geen-gekorrigeerde lugwegoppervlakselle wat met sistiese fibrose geassosieer word, wat lewenslange voordele tot gevolg het.LV vektore moet teen die geleidende lugweë gerig word, aangesien dit is waar longbetrokkenheid by CF begin.Aflewering van die vektor dieper in die long kan lei tot alveolêre transduksie, maar dit het geen terapeutiese effek in sistiese fibrose nie.Vloeistowwe soos geendraers migreer egter natuurlik na die alveoli wanneer dit na bevalling ingeasem word3,4 en terapeutiese deeltjies word vinnig deur MCT's in die mondholte uitgedryf.Die doeltreffendheid van LV-transduksie is direk verwant aan die tydsduur wat die vektor naby die teikenselle bly om sellulêre opname moontlik te maak – “verblyftyd” 5 wat maklik verkort word deur tipiese streekslugvloei sowel as gekoördineerde opname van slym en MCT-deeltjies.Vir sistiese fibrose is die vermoë om LV-verblyftyd in die lugweë te verleng belangrik om hoë vlakke van transduksie in hierdie area te bereik, maar was tot dusver uitdagend.
Om hierdie struikelblok te oorkom, stel ons voor dat LV magnetiese deeltjies (LP's) op twee komplementêre maniere kan help.Eerstens kan hulle deur 'n magneet na die lugwegoppervlak gelei word om teiken te verbeter en geendraerdeeltjies te help om in die regte area van die lugweg te wees;en ASL) beweeg na sellaag 6. LP's word wyd gebruik as geteikende middelafleweringsvoertuie wanneer hulle bind aan teenliggaampies, chemoterapiemiddels of ander klein molekules wat aan selmembrane heg of aan hul onderskeie seloppervlakreseptore bind en op tumorplekke ophoop in teenwoordigheid van statiese elektrisiteit.Magnetiese velde vir kankerterapie 7. Ander "hipertermiese" metodes is daarop gemik om tumorselle dood te maak deur LP's te verhit wanneer dit aan ossillerende magnetiese velde blootgestel word.Die beginsel van magnetiese transfeksie, waarin 'n magnetiese veld as 'n transfeksie-middel gebruik word om die oordrag van DNA in selle te verbeter, word algemeen in vitro gebruik deur 'n reeks nie-virale en virale geenvektore vir sellyne wat moeilik oorgedra kan word. ..Die doeltreffendheid van LV magnetotransfeksie met die aflewering van LV MP in vitro in 'n sellyn van menslike brongiale epiteel in die teenwoordigheid van 'n statiese magnetiese veld is vasgestel, wat die doeltreffendheid van transduksie met 186 keer verhoog in vergelyking met die LV vektor alleen.LV MT is ook toegepas op 'n in vitro model van sistiese fibrose, waar magnetiese transfeksie LV transduksie in lug-vloeistof koppelvlakkulture met 'n faktor van 20 in die teenwoordigheid van sistiese fibrose sputum verhoog10.In vivo orgaanmagnetotransfeksie het egter relatief min aandag gekry en is slegs in 'n paar dierestudies geëvalueer11,12,13,14,15, veral in die longe16,17.Die moontlikhede van magnetiese transfeksie in longterapie in sistiese fibrose is egter duidelik.Tan et al.(2020) het gesê dat "'n bekragtigingstudie oor effektiewe pulmonale aflewering van magnetiese nanopartikels die weg sal baan vir toekomstige CFTR-inasemingstrategieë om kliniese uitkomste by pasiënte met sistiese fibrose te verbeter"6.
Die gedrag van klein magnetiese deeltjies op die oppervlak van die respiratoriese kanaal in die teenwoordigheid van 'n toegepaste magnetiese veld is moeilik om te visualiseer en te bestudeer, en daarom word hulle swak verstaan.In ander studies het ons 'n Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) metode ontwikkel vir nie-indringende beelding en kwantifisering van minuut in vivo veranderinge in ASL18 diepte en MCT19 gedrag,20 om gaskanaal oppervlakhidrasie direk te meet en word gebruik as 'n vroeë aanwyser behandeling doeltreffendheid.Boonop gebruik ons ​​MCT-tellingmetode deeltjies van 10–35 µm deursnee wat bestaan ​​uit alumina of hoë brekingsindeksglas as MCT-merkers wat met PB-PCXI21 sigbaar is.Albei metodes is geskik vir die beeld van 'n reeks deeltjietipes, insluitend LP's.
As gevolg van die hoë ruimtelike en tydelike resolusie, is ons PB-PCXI-gebaseerde ASL- en MCT-toetse goed geskik om die dinamika en gedragspatrone van enkel- en grootmaatdeeltjies in vivo te bestudeer om ons te help om MP-geenleweringsmetodes te verstaan ​​en te optimaliseer.Die benadering wat ons hier gebruik, is gebaseer op ons studies wat die SPring-8 BL20B2-straallyn gebruik, waarin ons vloeistofbeweging gevisualiseer het na die aflewering van 'n dosis van 'n dummy-vektor in die nasale en pulmonêre lugweë van muise om te help om ons heterogene geenuitdrukkingspatrone wat waargeneem is, te verduidelik in ons geen.dierestudies met 'n draer dosis van 3,4.
Die doel van hierdie studie was om die PB-PCXI sinchrotron te gebruik om in vivo bewegings van 'n reeks LP's in die tragea van lewende rotte te visualiseer.Hierdie PB-PCXI-beeldingstudies is ontwerp om die MP-reeks, magnetiese veldsterkte en ligging te toets om hul effek op MP-beweging te bepaal.Ons het aangeneem dat 'n eksterne magnetiese veld die afgelewerde MF sou help om te bly of na die teikenarea te beweeg.Hierdie studies het ons ook in staat gestel om magneetkonfigurasies te bepaal wat die hoeveelheid deeltjies wat in die tragea agterbly na afsetting maksimeer.In 'n tweede reeks studies het ons ten doel gehad om hierdie optimale konfigurasie te gebruik om die transduksiepatroon te demonstreer wat voortspruit uit in vivo lewering van LV-MP's aan die rotlugweë, met die aanname dat aflewering van LV-MP's in die konteks van lugwegteikening sou lei. in verhoogde LV transduksie doeltreffendheid..
Alle dierestudies is uitgevoer in ooreenstemming met protokolle wat deur die Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en die SPring-8 Synchrotron Diere-etiekkomitee goedgekeur is.Die eksperimente is uitgevoer in ooreenstemming met die aanbevelings van ARRIVE.
Alle x-straalbeelde is geneem by die BL20XU-straallyn by die SPring-8-sinchrotron in Japan met 'n opstelling soortgelyk aan dié wat voorheen beskryf is21,22.Kortliks, die eksperimentele boks was 245 m van die sinchrotronopbergring geleë.'n Monster-tot-detektor-afstand van 0.6 m word gebruik vir partikelbeeldingstudies en 0.3 m vir in vivo beeldingstudies om fasekontraseffekte te skep.'n Monochromatiese straal met 'n energie van 25 keV is gebruik.Die beelde is verkry deur gebruik te maak van 'n hoë resolusie X-straal-omskakelaar (SPring-8 BM3) gekoppel aan 'n sCMOS-detektor.Die omskakelaar skakel X-strale om na sigbare lig met behulp van 'n 10 µm dik scintillator (Gd3Al2Ga3O12), wat dan na die sCMOS-sensor gerig word deur 'n ×10 (NA 0.3) mikroskoop-objektief te gebruik.Die sCMOS-detektor was 'n Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met 'n skikkingsgrootte van 2048 × 2048 piksels en 'n rou piekselgrootte van 6.5 × 6.5 µm.Hierdie instelling gee 'n effektiewe isotropiese pixelgrootte van 0.51 µm en 'n gesigsveld van ongeveer 1.1 mm × 1.1 mm.Die blootstellingsduur van 100 ms is gekies om die sein-tot-geraas-verhouding van magnetiese deeltjies binne en buite die lugweë te maksimeer, terwyl bewegingsartefakte wat deur asemhaling veroorsaak word, tot die minimum beperk word.Vir in vivo studies is 'n vinnige X-straalsluiter in die X-straalpad geplaas om die stralingsdosis te beperk deur die X-straalstraal tussen blootstellings te blokkeer.
LV media is nie in enige SPring-8 PB-PCXI beeldingstudies gebruik nie omdat die BL20XU beeldkamer nie Bioveiligheid Vlak 2 gesertifiseer is nie.In plaas daarvan het ons 'n reeks goedgekarakteriseerde LP's van twee kommersiële verskaffers gekies wat 'n reeks groottes, materiale, ysterkonsentrasies en toepassings dek, - eerstens om te verstaan ​​hoe magnetiese velde die beweging van LP's in glaskapillêre beïnvloed, en dan in lewende lugweë.oppervlak.Die grootte van die MP wissel van 0.25 tot 18 µm en is gemaak van verskeie materiale (sien Tabel 1), maar die samestelling van elke monster, insluitend die grootte van die magnetiese deeltjies in die MP, is onbekend.Gebaseer op ons uitgebreide MCT-studies 19, 20, 21, 23, 24, verwag ons dat LP's tot 5 µm op die trageale lugwegoppervlak gesien kan word, byvoorbeeld deur opeenvolgende rame af te trek om verbeterde sigbaarheid van MP-beweging te sien.’n Enkele MP van 0.25 µm is kleiner as die resolusie van die beeldapparaat, maar daar word verwag dat PB-PCXI hul volumetriese kontras en die beweging van die oppervlakvloeistof waarop hulle neergesit is, sal opspoor nadat dit neergelê is.
Monsters vir elke LP in die tabel.1 is voorberei in 20 μl glaskapillêre (Drummond Microcaps, PA, VSA) met 'n interne deursnee van 0.63 mm.Korpuskulêre deeltjies is in water beskikbaar, terwyl CombiMag-deeltjies in die vervaardiger se eie vloeistof beskikbaar is.Elke buis word half met vloeistof (ongeveer 11 µl) gevul en op die monsterhouer geplaas (sien Figuur 1).Die glaskapillêre is onderskeidelik horisontaal op die verhoog in die beeldkamer geplaas en aan die rande van die vloeistof geplaas.'n 19 mm deursnee (28 mm lank) nikkel-dop-magneet gemaak van seldsame aarde, neodimium, yster en boor (NdFeB) (N35, kat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australië) met 'n remanensie van 1,17 T is aan 'n aparte oordragtabel om te bereik Verander jou posisie op afstand tydens lewering.X-straalbeelding begin wanneer die magneet ongeveer 30 mm bokant die monster geplaas word en beelde word teen 4 rame per sekonde verkry.Tydens beeldvorming is die magneet naby die glaskapillêre buis gebring (op 'n afstand van ongeveer 1 mm) en dan langs die buis beweeg om die effek van veldsterkte en posisie te bepaal.
'n In vitro-beeldopstelling wat MP-monsters in glaskapillêre bevat op die stadium van translasie van die xy-monster.Die pad van die X-straalstraal is met 'n rooi stippellyn gemerk.
Sodra die in vitro sigbaarheid van LP's vasgestel is, is 'n subset van hulle in vivo getoets op wilde-tipe vroulike Wistar-albino-rotte (~12 weke oud, ~200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rotte is verdoof met Pharma (Japan) mengsel deur intraperitoneale inspuiting.Na narkose is hulle voorberei vir beeldvorming deur die pels rondom die tragea te verwyder, 'n endotrageale buis (ET; 16 Ga intraveneuse kanule, Terumo BCT) in te plaas en hulle in die rugliggende posisie te immobiliseer op 'n pasgemaakte beeldplaat wat 'n termiese sak bevat liggaamstemperatuur te handhaaf.22. Die beeldplaat is dan teen 'n effense hoek aan die monsterstadium in die beeldkas vasgemaak om die tragea horisontaal op die x-straalbeeld in lyn te bring soos in Figuur 2a getoon.
(a) In vivo beeldopstelling in die SPring-8 beeldeenheid, X-straalstraalpad gemerk met rooi stippellyn.(b,c) Trageale magneet lokalisering is op afstand uitgevoer met behulp van twee ortogonaal gemonteerde IP kameras.Aan die linkerkant van die prent op die skerm kan jy die draadlus sien wat die kop vashou en die afleweringskanule binne die ET-buis geïnstalleer.
'n Afstandbeheerde spuitpompstelsel (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) wat 'n 100 µl glasspuit gebruik het, is met 'n 30 Ga-naald aan 'n PE10-buis (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) gekoppel.Merk die buis om te verseker dat die punt in die korrekte posisie in die tragea is wanneer die endotrageale buis ingebring word.Met behulp van 'n mikropomp is die spuitsuier verwyder en die punt van die buis is in die MP-monster gedompel wat afgelewer moet word.Die gelaaide afleweringsbuis is dan in die endotrageale buis geplaas, en plaas die punt op die sterkste deel van ons verwagte toegepaste magnetiese veld.Beeldverkryging is beheer met behulp van 'n asemdetektor wat aan ons Arduino-gebaseerde tydsberekeningsboks gekoppel is, en alle seine (bv. temperatuur, asemhaling, sluiter oop/toe, en beeldverkryging) is opgeneem met behulp van Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22 Wanneer beeldvorming Wanneer die behuising nie beskikbaar was nie, is twee IP-kameras (Panasonic BB-SC382) teen ongeveer 90° van mekaar geplaas en gebruik om die posisie van die magneet relatief tot die tragea tydens beelding te beheer (Figuur 2b, c).Om bewegingsartefakte te minimaliseer, is een beeld per asemhaling verkry tydens die terminale respiratoriese vloeiplato.
Die magneet is aan die tweede fase vasgemaak, wat op 'n afstand aan die buitekant van die beeldliggaam geleë kan wees.Verskeie posisies en konfigurasies van die magneet is getoets, insluitend: geplaas teen 'n hoek van ongeveer 30° bokant die tragea (konfigurasies word in Figure 2a en 3a getoon);een magneet bo die dier en die ander onder, met die pole ingestel vir aantrekking (Figuur 3b)., een magneet bo die dier en een onder, met die pole ingestel vir afstoting (Figuur 3c), en een magneet bo en loodreg op die tragea (Figuur 3d).Nadat die dier en magneet opgestel is en die MP wat getoets word in die spuitpomp gelaai is, lewer 'n dosis van 50 µl teen 'n tempo van 4 µl/sek by verkryging van beelde.Die magneet word dan heen en weer langs of oor die tragea beweeg terwyl dit voortgaan om beelde te verkry.
Magneetkonfigurasie vir in vivo beeldvorming (a) een magneet bokant die tragea teen 'n hoek van ongeveer 30°, (b) twee magnete gekonfigureer vir aantrekking, (c) twee magnete gekonfigureer vir afstoting, (d) een magneet bo en loodreg op die tragea.Die waarnemer het van die mond af na die longe deur die tragea gekyk en die X-straalstraal het deur die linkerkant van die rot gegaan en die regterkant verlaat.Die magneet word óf langs die lengte van die lugweg beweeg óf links en regs bokant die tragea in die rigting van die X-straalstraal.
Ons het ook probeer om die sigbaarheid en gedrag van deeltjies in die lugweë te bepaal in die afwesigheid van vermenging van asemhaling en hartklop.Daarom, aan die einde van die beeldingsperiode, is diere menslik doodgemaak weens pentobarbital-oordosis (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, VSA; ~65 mg/kg ip).Sommige diere is op die beeldplatform gelaat, en na die staking van asemhaling en hartklop is die beeldproses herhaal, en 'n bykomende dosis MP bygevoeg indien geen MP op die lugwegoppervlak sigbaar was nie.
Die gevolglike beelde is gekorrigeer vir plat en donker veld en dan saamgestel in 'n fliek (20 rame per sekonde; 15–25 × normale spoed afhangende van respirasietempo) met behulp van 'n pasgemaakte skrif geskryf in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle studies oor LV geenvektor aflewering is by die Universiteit van Adelaide Laboratorium Dierenavorsingsentrum uitgevoer en het ten doel gehad om die resultate van die SPring-8 eksperiment te gebruik om te bepaal of LV-MP aflewering in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld geenoordrag in vivo kan verbeter .Om die effekte van MF en magnetiese veld te evalueer, is twee groepe diere behandel: een groep is ingespuit met LV MF met magneetplasing, en die ander groep is ingespuit met 'n kontrolegroep met LV MF sonder magneet.
LV geen vektore is gegenereer met behulp van voorheen beskryf metodes 25, 26.Die LacZ-vektor druk 'n kerngelokaliseerde beta-galaktosidase-geen uit wat aangedryf word deur die MPSV-konstitutiewe promotor (LV-LacZ), wat 'n blou reaksieproduk in getransduseerde selle produseer, sigbaar op fronte en dele van longweefsel.Titrasie is in selkulture uitgevoer deur die aantal LacZ-positiewe selle handmatig te tel deur 'n hemositometer te gebruik om die titer in TU/ml te bereken.Draers word gekruipreserveer by -80°C, ontdooi voor gebruik, en gebind aan CombiMag deur 1:1 te meng en vir ten minste 30 minute op ys te inkubeer voor aflewering.
Normale Sprague Dawley-rotte (n = 3/groep, ~2-3 verdoof ip met 'n mengsel van 0.4mg/kg medetomidien (Domitor, Ilium, Australië) en 60mg/kg ketamien (Ilium, Australië) op 1 maand ouderdom) ip ) inspuiting en nie-chirurgiese orale kanulasie met 'n 16 Ga binneaarse kanule.Om te verseker dat trageale lugwegweefsel LV-transduksie ontvang, is dit gekondisioneer deur gebruik te maak van ons voorheen beskryfde meganiese versteuringsprotokol waarin die trageale lugwegoppervlak aksiaal gevryf is met 'n draadmandjie (N-Circle, nitinol klip ekstraker sonder punt NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, VSA) 30 p28.Toe, ongeveer 10 minute na die versteuring in die bioveiligheidskas, is trageale toediening van LV-MP uitgevoer.
Die magnetiese veld wat in hierdie eksperiment gebruik is, is soortgelyk gekonfigureer as 'n in vivo x-straal studie, met dieselfde magnete wat oor die tragea gehou is met distillasie stent klampe (Figuur 4).'n 50 µl volume (2 x 25 µl aliquots) van LV-MP is aan die tragea (n = 3 diere) gelewer deur gebruik te maak van 'n jel-punt pipet soos voorheen beskryf.Die kontrolegroep (n = 3 diere) het dieselfde LV-MP ontvang sonder die gebruik van 'n magneet.Na voltooiing van die infusie word die kanule uit die endotrageale buis verwyder en die dier word geëkstubeer.Die magneet bly vir 10 minute in plek voordat dit verwyder word.Rotte is subkutaan gedoseer met meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australië) gevolg deur narkose-onttrekking deur intraperitoneale inspuiting van 1 mg/kg atipamazole hidrochloried (Antisedan, Zoetis, Australië).Rotte is warm gehou en waargeneem tot volkome herstel van narkose.
LV-MP afleweringstoestel in 'n biologiese veiligheidskas.Jy kan sien dat die liggrys Luer-slot-huls van die ET-buis by die mond uitsteek, en die jelpipetpunt wat in die figuur gewys word, word deur die ET-buis tot die verlangde diepte in die tragea geplaas.
Een week na die LV-MP toedieningsprosedure is diere menslik geoffer deur inaseming van 100% CO2 en LacZ uitdrukking is geassesseer met behulp van ons standaard X-gal behandeling.Die drie mees caudale kraakbeenringe is verwyder om te verseker dat enige meganiese skade of vloeistofretensie as gevolg van endotrageale buisplasing nie by die analise ingesluit sal word nie.Elke tragea is in die lengte gesny om twee helftes vir ontleding te verkry en in 'n koppie wat silikoonrubber bevat (Sylgard, Dow Inc) geplaas met 'n Minutien-naald (Fine Science Tools) om die luminale oppervlak te visualiseer.Die verspreiding en karakter van die getransduseerde selle is bevestig deur frontale fotografie met behulp van 'n Nikon-mikroskoop (SMZ1500) met 'n DigiLite-kamera en TCapture-sagteware (Tucsen Photonics, China).Beelde is verkry teen 20x vergroting (insluitend die maksimum instelling vir die volle breedte van die tragea), met die hele lengte van die tragea stap vir stap vertoon, wat genoeg oorvleueling tussen elke beeld verskaf om beelde toe te laat om "gestik" te word.Die beelde van elke tragea is dan gekombineer in 'n enkele saamgestelde beeld met behulp van Composite Image Editor weergawe 2.0.3 (Microsoft Research) met behulp van die planêre bewegingsalgoritme. Die area van LacZ-uitdrukking binne die trageale saamgestelde beelde van elke dier is gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n outomatiese MATLAB-skrif (R2020a, MathWorks) soos voorheen beskryf28, met instellings van 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, en Value < 0.7. Die area van LacZ-uitdrukking binne die trageale saamgestelde beelde van elke dier is gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n outomatiese MATLAB-skrif (R2020a, MathWorks) soos voorheen beskryf28, met instellings van 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, en Value < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Die area van LacZ-uitdrukking in saamgestelde trageale beelde van elke dier is gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n outomatiese MATLAB-skrif (R2020a, MathWorks) soos voorheen beskryf28 deur instellings van 0.35 te gebruik0,15 en waarde<0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， Wiskunde） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 进行 量化 ， 使用 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的 设置。。。如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Areas van LacZ-uitdrukking op saamgestelde beelde van die tragea van elke dier is gekwantifiseer deur gebruik te maak van 'n outomatiese MATLAB-skrif (R2020a, MathWorks) soos voorheen beskryf deur instellings van 0.35 < tint < 0.58, versadiging > 0.15 en waarde < 0.7 .Deur weefselkontoere in GIMP v2.10.24 na te spoor, is 'n masker met die hand vir elke saamgestelde beeld geskep om die weefselarea te identifiseer en enige vals bespeurings buite die trageale weefsel te voorkom.Die gekleurde areas van alle saamgestelde beelde van elke dier is opgetel om die totale gekleurde area vir daardie dier te gee.Die geverfde area is dan gedeel deur die totale oppervlakte van die masker om 'n genormaliseerde area te verkry.
Elke tragea is in paraffien ingebed en 5 µm dik gesny.Seksies is teengekleur met neutraal vinnig rooi vir 5 minute en beelde is verkry met behulp van 'n Nikon Eclipse E400 mikroskoop, DS-Fi3 kamera en NIS element vaslegging sagteware (weergawe 5.20.00).
Alle statistiese ontledings is uitgevoer in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistiese betekenisvolheid is op p ≤ 0.05 gestel.Normaliteit is getoets met behulp van die Shapiro-Wilk-toets en verskille in LacZ-kleuring is geassesseer met 'n ongepaarde t-toets.
Die ses LP's wat in Tabel 1 beskryf word, is deur PCXI ondersoek, en die sigbaarheid word in Tabel 2 beskryf. Twee polistireen-MP's (MP1 en MP2; 18 µm en 0.25 µm onderskeidelik) was nie deur PCXI sigbaar nie, maar die oorblywende monsters kon geïdentifiseer word (Voorbeelde word in Figuur 5 getoon).MP3 en MP4 is swak sigbaar (10-15% Fe3O4; 0,25 µm en 0,9 µm onderskeidelik).Alhoewel MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) van die kleinste deeltjies bevat het wat getoets is, was dit die mees uitgespreek.Die CombiMag MP6-produk is moeilik om te onderskei.In alle gevalle is ons vermoë om MF's op te spoor aansienlik verbeter deur die magneet heen en weer parallel met die kapillêre te beweeg.Soos die magnete van die kapillêre wegbeweeg het, is die deeltjies in lang kettings uitgetrek, maar soos die magnete nader gekom het en die magneetveldsterkte toegeneem het, het die deeltjiekettings verkort namate die deeltjies na die boonste oppervlak van die kapillêre migreer migreer (sien Aanvullende Video S1 : MP4), wat die partikeldigtheid aan die oppervlak verhoog.Omgekeerd, wanneer die magneet van die kapillêre verwyder word, neem die veldsterkte af en herrangskik die MP's in lang kettings wat strek vanaf die boonste oppervlak van die kapillêre (sien Aanvullende Video S2: MP4).Nadat die magneet ophou beweeg, bly die deeltjies vir 'n geruime tyd beweeg nadat hulle die ewewigsposisie bereik het.Soos die MP na en weg van die boonste oppervlak van die kapillêre beweeg, is die magnetiese deeltjies geneig om puin deur die vloeistof te trek.
Die sigbaarheid van MP onder PCXI verskil aansienlik tussen monsters.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Alle beelde wat hier gewys word, is geneem met 'n magneet wat ongeveer 10 mm direk bokant die kapillêre posisie geplaas is.Die oënskynlike groot sirkels is lugborrels wat in die kapillêre vasgevang is, wat die swart en wit randkenmerke van die fasekontrasbeeld duidelik toon.Die rooi blokkie dui die vergroting aan wat die kontras verhoog.Let daarop dat die diameters van die magneetkringe in alle figure nie volgens skaal is nie en ongeveer 100 keer groter is as wat getoon word.
Soos die magneet links en regs langs die bokant van die kapillêre beweeg, verander die hoek van die MP-string om in lyn te wees met die magneet (sien Figuur 6), om sodoende die magnetiese veldlyne te omlyn.Vir MP3-5, nadat die koord die drumpelhoek bereik het, sleep die deeltjies langs die boonste oppervlak van die kapillêre.Dit lei dikwels daartoe dat LP's in groter groepe groepeer naby waar die magneetveld die sterkste is (sien Aanvullende Video S3: MP5).Dit is ook veral duidelik wanneer beelding naby die einde van die kapillêre beeld gemaak word, wat veroorsaak dat die MP saamvoeg en konsentreer by die vloeistof-lug-koppelvlak.Die deeltjies in die MP6, wat moeiliker was om te onderskei as dié in die MP3-5, het nie gesleep toe die magneet langs die kapillêre beweeg het nie, maar die MP-stringe het gedissosieer en die deeltjies in sig gelaat (sien Aanvullende Video S4: MP6).In sommige gevalle, wanneer die toegepaste magneetveld verminder is deur die magneet 'n lang afstand van die beeldingsplek te beweeg, het enige oorblywende LP's stadig na die onderste oppervlak van die buis gedaal deur swaartekrag, wat in die tou gebly het (sien aanvullende video S5: MP3) .
Die hoek van die MP-string verander soos die magneet na regs bokant die kapillêre beweeg.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Die rooi blokkie dui die vergroting aan wat die kontras verhoog.Neem asseblief kennis dat die bykomende video's vir inligtingsdoeleindes is, aangesien dit belangrike deeltjiestruktuur en dinamiese inligting openbaar wat nie in hierdie statiese beelde gevisualiseer kan word nie.
Ons toetse het getoon dat die beweging van die magneet stadig heen en weer langs die tragea die visualisering van die MF in die konteks van komplekse beweging in vivo vergemaklik.Geen in vivo toetse is uitgevoer nie omdat die polistireenkrale (MP1 en MP2) nie in die kapillêre sigbaar was nie.Elk van die oorblywende vier MF'e is in vivo getoets met die lang-as van die magneet oor die tragea geplaas teen 'n hoek van ongeveer 30° met die vertikaal (sien Figuur 2b en 3a), aangesien dit langer MF-kettings tot gevolg gehad het en meer effektief was as 'n magneet..konfigurasie beëindig.MP3, MP4 en MP6 is nie in die tragea van enige lewende diere gevind nie.Wanneer die respiratoriese kanaal van rotte gevisualiseer is nadat die diere menslik doodgemaak is, het die deeltjies onsigbaar gebly selfs wanneer addisionele volume bygevoeg is met behulp van 'n spuitpomp.MP5 het die hoogste ysteroksiedinhoud gehad en was die enigste sigbare deeltjie, dus is dit gebruik om MP-gedrag in vivo te evalueer en te karakteriseer.
Die plasing van die magneet oor die tragea tydens MF-invoeging het daartoe gelei dat baie, maar nie almal nie, MF's in die gesigsveld gekonsentreer is.Trageale binnedringing van deeltjies word die beste waargeneem by diere wat menslik geëuthaniseer is.Figuur 7 en aanvullende video S6: MP5 toon vinnige magnetiese vaslegging en belyning van deeltjies op die oppervlak van die ventrale tragea, wat aandui dat LP's op gewenste areas van die tragea geteiken kan word.Wanneer meer distaal langs die tragea gesoek is na MF-aflewering, is sommige MF's nader aan die karina gevind, wat dui op onvoldoende magnetiese veldsterkte om alle MF's te versamel en te hou, aangesien hulle deur die gebied van maksimum magnetiese veldsterkte tydens vloeistoftoediening afgelewer is.proses.Postnatale MP-konsentrasies was egter hoër rondom die beeldarea, wat daarop dui dat baie MP's in lugwegstreke gebly het waar die toegepaste magnetiese veldsterkte die hoogste was.
Beelde van (a) voor en (b) na aflewering van MP5 in die tragea van 'n onlangs geëuthaniseerde rot met 'n magneet wat net bokant die beeldarea geplaas is.Die afgebeelde area is tussen twee kraakbeenringe geleë.Daar is 'n bietjie vloeistof in die lugweë voordat die MP gelewer word.Die rooi blokkie dui die vergroting aan wat die kontras verhoog.Hierdie beelde is geneem uit die video wat in S6: MP5 Aanvullende Video verskyn.
Die beweging van die magneet langs die tragea in vivo het gelei tot 'n verandering in die hoek van die MP-ketting op die lugwegoppervlak, soortgelyk aan dié wat in kapillêre waargeneem word (sien Figuur 8 en Aanvullende Video S7: MP5).In ons studie kon LP's egter nie langs die oppervlak van lewende lugweë gesleep word nie, soos kapillêre kan doen.In sommige gevalle word die MP-ketting verleng soos die magneet links en regs beweeg.Interessant genoeg het ons ook gevind dat die deeltjieketting die diepte van die oppervlaklaag van die vloeistof verander wanneer die magneet in die lengte langs die tragea beweeg word, en uitsit wanneer die magneet direk bo-oor beweeg word en die deeltjieketting na 'n vertikale posisie geroteer word (sien Aanvullende video S7).: MP5 om 0:09, regs onder).Die kenmerkende bewegingspatroon het verander toe die magneet lateraal oor die bokant van die tragea beweeg is (dws links of regs van die dier, eerder as langs die lengte van die tragea).Die deeltjies was nog duidelik sigbaar tydens hul beweging, maar toe die magneet uit die tragea verwyder is, het die punte van die deeltjiesstringe sigbaar geword (sien Aanvullende Video S8: MP5, wat om 0:08 begin).Dit stem ooreen met die waargenome gedrag van die magnetiese veld onder die werking van 'n toegepaste magneetveld in 'n glaskapillêre.
Voorbeeldbeelde wat MP5 in die tragea van 'n lewendige verdoofde rot wys.(a) Die magneet word gebruik om beelde bo en links van die tragea te verkry, dan (b) nadat die magneet na regs geskuif is.Die rooi blokkie dui die vergroting aan wat die kontras verhoog.Hierdie beelde is van die video wat in S7 se aanvullende video verskyn: MP5.
Wanneer die twee pole in 'n noord-suid-oriëntasie bo en onder die tragea gestem is (dws aantrek; Fig. 3b), het die MP-akkoorde langer verskyn en was op die laterale wand van die tragea geleë eerder as op die dorsale oppervlak van die tragea. tragea (sien Bylaag).Video S9:MP5).Hoë konsentrasies deeltjies op een plek (dws die dorsale oppervlak van die tragea) is egter nie opgespoor na vloeistoftoediening met 'n dubbele magneettoestel, wat gewoonlik met 'n enkele magneettoestel voorkom nie.Toe, toe een magneet gekonfigureer is om teenoorgestelde pole af te weer (Figuur 3c), het die aantal deeltjies wat in die gesigsveld sigbaar was nie na aflewering toegeneem nie.Die opstel van beide twee magneetkonfigurasies is uitdagend as gevolg van die hoë magnetiese veldsterkte wat die magnete onderskeidelik aantrek of stoot.Die opstelling is toe verander na 'n enkele magneet parallel aan die lugweë, maar wat deur die lugweë gaan teen 'n 90 grade hoek sodat die kraglyne die trageale wand ortogonaal gekruis het (Figuur 3d), 'n oriëntasie wat bedoel is om die moontlikheid van deeltjie-aggregasie op die sywand.waargeneem word.In hierdie konfigurasie was daar egter geen identifiseerbare MF-akkumulasiebeweging of magneetbeweging nie.Gebaseer op al hierdie resultate, is 'n konfigurasie met 'n enkele magneet en 'n 30-grade oriëntasie gekies vir in vivo studies van geendraers (Fig. 3a).
Wanneer die dier verskeie kere afgebeeld is onmiddellik nadat dit menslik geoffer is, het die afwesigheid van steurende weefselbeweging beteken dat fyner, korter deeltjielyne in die duidelike interkraakbeenveld waargeneem kon word, wat 'swaai' in ooreenstemming met die translasiebeweging van die magneet.sien duidelik die teenwoordigheid en beweging van MP6-deeltjies.
Die titer van LV-LacZ was 1,8 x 108 IE/ml, en na gemeng 1:1 met CombiMag MP (MP6), is diere ingespuit met 50 µl van 'n trageale dosis van 9 x 107 IE/ml LV-voertuig (dws 4,5) x 106 TU/rot).).).In hierdie studies, in plaas daarvan om die magneet tydens kraam te beweeg, het ons die magneet in een posisie vasgemaak om te bepaal of LV-transduksie (a) verbeter kan word in vergelyking met vektorlewering in die afwesigheid van 'n magneetveld, en (b) as die lugweg kan gefokus wees.Die selle word getransduseer in die magnetiese teikenareas van die boonste lugweg.
Die teenwoordigheid van magnete en die gebruik van CombiMag in kombinasie met LV vektore het blykbaar nie dieregesondheid nadelig beïnvloed nie, so ook ons ​​standaard LV vektor afleweringsprotokol.Frontale beelde van die trageale streek wat aan meganiese versteuring onderwerp is (Aanvullende Fig. 1) het getoon dat die LV-MP-behandelde groep aansienlik hoër vlakke van transduksie gehad het in die teenwoordigheid van 'n magneet (Fig. 9a).Slegs 'n klein hoeveelheid blou LacZ-kleuring was teenwoordig in die kontrolegroep (Figuur 9b).Kwantifisering van X-Gal-gekleurde genormaliseerde streke het getoon dat toediening van LV-MP in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld 'n ongeveer 6-voudige verbetering tot gevolg gehad het (Fig. 9c).
Voorbeeld van saamgestelde beelde wat trageale transduksie met LV-MP toon (a) in die teenwoordigheid van 'n magneetveld en (b) in die afwesigheid van 'n magneet.(c) Statisties beduidende verbetering in die genormaliseerde area van LacZ-transduksie in die tragea met die gebruik van 'n magneet (*p = 0.029, t-toets, n = 3 per groep, gemiddelde ± standaardfout van die gemiddelde).
Neutrale vinnige rooi-gekleurde afdelings (voorbeeld getoon in Aanvullende Fig. 2) het aangedui dat LacZ-gekleurde selle teenwoordig was in dieselfde monster en op dieselfde plek as wat voorheen gerapporteer is.
Die sleuteluitdaging in lugweggeneterapie bly die presiese lokalisering van draerdeeltjies in areas van belang en die bereiking van 'n hoë vlak van transduksiedoeltreffendheid in die mobiele long in die teenwoordigheid van lugvloei en aktiewe slymopruiming.Vir LV-draers wat bedoel is vir die behandeling van respiratoriese siektes in sistiese fibrose, was die verhoging van die verblyftyd van die draerdeeltjies in die geleidende lugweë tot dusver 'n onbereikbare doelwit.Soos uitgewys deur Castellani et al., het die gebruik van magnetiese velde om transduksie te verbeter voordele bo ander geenleweringsmetodes soos elektroporasie omdat dit eenvoud, ekonomie, gelokaliseerde aflewering, verhoogde doeltreffendheid en korter inkubasietyd kan kombineer.en moontlik 'n laer dosis voertuig10.In vivo afsetting en gedrag van magnetiese deeltjies in die lugweë onder die invloed van eksterne magnetiese kragte is egter nog nooit beskryf nie, en in werklikheid is die vermoë van hierdie metode om geenuitdrukkingvlakke in ongeskonde lewende lugweë te verhoog nie in vivo gedemonstreer nie.
Ons in vitro eksperimente op die PCXI sinchrotron het getoon dat al die deeltjies wat ons getoets het, met die uitsondering van die MP polistireen, sigbaar was in die beeldopstelling wat ons gebruik het.In die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld vorm magnetiese velde stringe waarvan die lengte verband hou met die tipe deeltjies en die sterkte van die magneetveld (dws die nabyheid en beweging van die magneet).Soos getoon in Figuur 10, word die stringe wat ons waarneem gevorm soos elke individuele deeltjie gemagnetiseer word en sy eie plaaslike magnetiese veld induseer.Hierdie afsonderlike velde veroorsaak dat ander soortgelyke deeltjies versamel en verbind word met groepsnaarbewegings as gevolg van plaaslike kragte van die plaaslike kragte van aantrekking en afstoot van ander deeltjies.
Diagram wat (a, b) kettings van deeltjies wat binne-in vloeistofgevulde kapillêre vorm en (c, d) 'n lug-gevulde tragea toon.Let daarop dat die kapillêre en tragea nie volgens skaal geteken is nie.Paneel (a) bevat ook 'n beskrywing van die MF-bevattende Fe3O4-deeltjies wat in kettings gerangskik is.
Wanneer die magneet oor die kapillêre beweeg het, het die hoek van die partikelstring die kritieke drempel bereik vir MP3-5 wat Fe3O4 bevat, waarna die partikelstring nie meer in sy oorspronklike posisie gebly het nie, maar langs die oppervlak na 'n nuwe posisie beweeg het.magneet.Hierdie effek vind waarskynlik plaas omdat die oppervlak van die glaskapillêre glad genoeg is om hierdie beweging te laat plaasvind.Interessant genoeg het MP6 (CombiMag) nie so opgetree nie, miskien omdat die deeltjies kleiner was, 'n ander laag of oppervlaklading gehad het, of die eie draervloeistof hul vermoë om te beweeg beïnvloed het.Die kontras in die CombiMag-deeltjiebeeld is ook swakker, wat daarop dui dat die vloeistof en deeltjies dieselfde digtheid kan hê en dus nie maklik na mekaar toe kan beweeg nie.Deeltjies kan ook vassit as die magneet te vinnig beweeg, wat aandui dat die magneetveldsterkte nie altyd die wrywing tussen deeltjies in die vloeistof kan oorkom nie, wat daarop dui dat die magneetveldsterkte en die afstand tussen die magneet en die teikenarea nie as 'n verras.belangrik.Hierdie resultate dui ook aan dat alhoewel magnete baie mikropartikels kan vang wat deur die teikenarea vloei, dit onwaarskynlik is dat daar op magnete staatgemaak kan word om CombiMag-deeltjies langs die oppervlak van die tragea te beweeg.Ons het dus tot die gevolgtrekking gekom dat in vivo LV MF-studies statiese magnetiese velde moet gebruik om spesifieke areas van die lugwegboom fisies te teiken.
Sodra die deeltjies in die liggaam afgelewer is, is dit moeilik om te identifiseer in die konteks van die komplekse bewegende weefsel van die liggaam, maar hul opsporingsvermoë is verbeter deur die magneet horisontaal oor die tragea te beweeg om die MP-stringe te "wik".Alhoewel intydse beeldvorming moontlik is, is dit makliker om deeltjiebeweging te onderskei nadat die dier menslik doodgemaak is.MP-konsentrasies was gewoonlik die hoogste by hierdie plek wanneer die magneet oor die beeldgebied geplaas is, hoewel sommige deeltjies gewoonlik verder af in die tragea gevind is.Anders as in vitro-studies, kan deeltjies nie deur die beweging van 'n magneet in die tragea afgetrek word nie.Hierdie bevinding stem ooreen met hoe die slym wat die oppervlak van die tragea bedek, tipies ingeasemde deeltjies verwerk, dit in die slym vasvang en dit dan deur die mukosiliêre opruimingsmeganisme skoonmaak.
Ons het veronderstel dat die gebruik van magnete bo en onder die tragea vir aantrekking (Fig. 3b) kan lei tot 'n meer eenvormige magnetiese veld, eerder as 'n magnetiese veld wat hoogs gekonsentreer is op een punt, wat moontlik 'n meer eenvormige verspreiding van deeltjies tot gevolg kan hê..Ons voorlopige studie het egter nie duidelike bewyse gevind om hierdie hipotese te ondersteun nie.Net so het die stel van 'n paar magnete om af te weer (Fig. 3c) nie daartoe gelei dat meer deeltjies in die beeldarea gesak het nie.Hierdie twee bevindinge toon dat die dubbelmagneet-opstelling nie die plaaslike beheer van MP-wysing aansienlik verbeter nie, en dat die gevolglike sterk magnetiese kragte moeilik is om in te stel, wat hierdie benadering minder prakties maak.Net so het die oriëntering van die magneet bo en oor die tragea (Figuur 3d) ook nie die aantal deeltjies wat in die afgebeelde area oorgebly het, verhoog nie.Sommige van hierdie alternatiewe konfigurasies sal dalk nie suksesvol wees nie, aangesien dit 'n vermindering in die magneetveldsterkte in die afsettingsone tot gevolg het.Dus, die enkele magneet konfigurasie by 30 grade (Fig. 3a) word beskou as die eenvoudigste en mees doeltreffende in vivo toets metode.
Die LV-MP studie het getoon dat wanneer LV vektore gekombineer is met CombiMag en afgelewer is nadat hulle fisies versteur is in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld, transduksievlakke aansienlik toegeneem het in die tragea in vergelyking met kontroles.Gebaseer op sinchrotronbeeldingstudies en LacZ-resultate, blyk dit dat die magnetiese veld in staat was om die LV in die tragea te hou en die aantal vektorpartikels wat onmiddellik diep in die long binnegedring het, te verminder.Sulke teikenverbeterings kan lei tot hoër doeltreffendheid terwyl gelewerde titers, nie-geteikende transduksie, inflammatoriese en immuun newe-effekte en geenoordragkoste verminder word.Wat belangrik is, volgens die vervaardiger, kan CombiMag in kombinasie met ander geenoordragmetodes gebruik word, insluitend ander virale vektore (soos AAV) en nukleïensure.